斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19～23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。     

荧光转基因斑马鱼Tg(ttn.2:EGFP)的构建

为了建立一种用于研究肌肉和心脏发育及其相关疾病的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因斑马鱼品系,本研究使用斑马鱼ttn.2基因编码区上游启动子序列和绿色荧光蛋白基因编码序列构建了重组表达载体,并将该载体和Tol2转座酶的加帽mRNA显微共注射入斑马鱼1-细胞期胚胎,通过荧光检测、遗传杂交筛选和分子鉴定等方法,成功建立了能稳定遗传的Tg(ttn.2:EGFP)转基因斑马鱼品系。荧光表达分析及原位杂交分析结果表明,绿色荧光信号在斑马鱼肌肉和心脏组织中特异表达模式与ttn.2基因的mRNA表达一致。通过反向PCR鉴定转基因表达载体在F1代斑马鱼品系中的随机整合位点,结果表明:No.33转基因品系的EGFP基因整合在斑马鱼的4号和11号染色体上,No.34转基因品系则整合在1号染色体上。该荧光转基因斑马鱼品系Tg(ttn.2:EGFP)的成功构建为肌肉和心脏发育以及相关疾病研究提供了一个新的理想实验模型。此外,绿色荧光强烈表达的斑马鱼品系还可以作为一种新的观赏鱼。     

利用CRISPR/Cas9技术建立斑马鱼Asb11基因敲除品系

Asb11基因被报道与斑马鱼Notch信号的激活有关,本研究室过去的研究显示该基因在心肌和骨骼肌中特异性表达。因此推测Asb11基因可能是心脏发育相关候选基因。为了阐明Asb11基因在斑马鱼心脏发育过程中的作用,本文利用CRISPR/Cas9打靶技术构建敲除Asb11基因的斑马鱼品系。首先在线分析筛选出Asb11基因最适合的打靶位点,然后PCR扩增出Asb11基因gRNA的双链c DNA,再将Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA共同注射到斑马鱼胚胎Ⅰ细胞期胚胎中。进行打靶的有效性检测,发现Asb11基因的一号外显子出现了碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对Asb11基因的敲除是有效的。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得了Asb11基因敲除的斑马鱼品系,为探究Asb11在心脏发育中的作用奠定了基础。     

拟南芥角质层发育突变体中WBC11基因的分析与鉴定

从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)突变体库中筛选到一个发育突变体ku7fy1,其突变表型为叶片狭长,生长缓慢。该研究利用图位克隆技术和候选基因测序鉴定出ku7fy1角质层发育基因(white-brown complex11,WBC11)有一个点突变。对该突变体cDNA测序结果显示,WBC11基因的突变导致其第7个内含子在形成成熟mRNA时无法被正常剪切,使该突变体内WBC11的mRNA大量降解并在翻译时提前引入终止密码子。甲苯胺蓝染色实验显示,突变体叶片表面角质层有缺陷;遗传互补实验进一步证明,突变体ku7fy1中的突变基因是WBC11,ku7fy1表型是由WBC11突变造成的。     

斑马鱼sat1.a突变体的鉴定

目的在我们的前期研究工作中,通过Tol2转座子介导的插入突变,筛选到了一批组织特异性表达绿色荧光蛋白GFP的斑马鱼品系。其中一个品系Tol2:20141221t的GFP在神经系统中表达,但还没有鉴定到Tol2转座子插入到基因组什么位置,造成了哪个基因的突变。本文的主要研究目标就是对这一由Tol2转座子插入诱导的斑马鱼突变品系进行鉴定。方法使用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)鉴定Tol2转座子插入的基因组位置;利用原位杂交检测被突变的基因的时空表达是否与该品系GFP表达具有一致性;筛选鉴定纯合体突变体,并进一步分析该基因突变造成的发育缺陷。结果在该品系中,Tol2转座子插入到了亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶1a(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1a,sat1.a)的第八个内含子区域,致使sat1.a基因转录提前终止。我们筛选到了sat1.a纯合突变体,但是没有检测到明显的发育缺陷。结论筛选鉴定的Tol2转座子介导的斑马鱼sat1.a突变体没有明显的发育缺陷,但可以作为研究神经系统发育的有力工具。     

斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建

MYO7A是人类Usher综合征(US)的致病基因。由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%～55%。研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型(USH1B),包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性(RP),但其分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制,利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该基因的向导DNA(gDNA),再以gDNA为模板转录得到向导RNA(gRNA),将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中;随后,进行基因编辑的有效性检测。研究结果表明,CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。对其进行进一步筛选,成功获得斑马鱼myo7ab基因敲除突变品系,这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。     

opn1lw2基因在红光诱导斑马鱼皮肤 色素细胞形成中的作用

为了探究感红光视蛋白2基因opn1lw2在红光诱导斑马鱼(Danio rerio)皮肤色素细胞形成中的作用,针对AB品系野生型斑马鱼利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除感红光视蛋白2基因opn1lw2,构建opn1lw2缺失的纯合opn1lw2~(-/-)品系。使用光强(800±100)lx的红光LED灯(每天光照24 h)对15日龄野生型斑马鱼和opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼进行60 d水面照射,发现野生型斑马鱼背部皮肤黑色素细胞数量显著多于opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼。实时荧光定量PCR分析发现,黑色素细胞标记基因kit在野生型斑马鱼背部皮肤表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,黄色素细胞标记基因csf1ra和虹彩细胞标记基因pnp4a在opn1lw2~(-/-)品系及野生斑马鱼背部皮肤表达无显著差异。表明红光能通过opn1lw2基因调控斑马鱼背部皮肤黑色素细胞的形成,但不影响皮肤黄色素细胞和虹彩细胞的形成;而且,调控黑色素细胞分化的α-MSH促黑激素的前体基因pomca在红光持续照射60d的opn1lw2~(-/-)品系斑马鱼背部皮肤中的表达显著低于野生型,表明红光通过opn1lw2基因调控pomca基因的表达从而诱导黑色素细胞的形成。实时荧光定量PCR检测发现,野生型斑马鱼皮肤中视黄醛脱氢酶基因raldh3表达量显著高于opn1lw2~(-/-)品系,而视黄醛脱氢酶基因raldh2的表达,在两种类型斑马鱼中没有差异,表明opn1lw2基因可介导红光诱导视黄醛脱氢酶基因raldh3表达,进而调控黑色素细胞的形成。这些结果对于深入理解红光诱导鱼类皮肤色素细胞形成有重要帮助。     

斑马鱼tbx2b调控心脏房室间隔发育的功能研究*

tbx2是早期心脏发育的关键基因。为进一步探究其对房室间隔(AVC)发育的影响,研究利用CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,成功构建了斑马鱼tbx2b突变体。通过T7E1酶切对其F₀进行敲除效率检测,结果显示平均敲除效率约为57.5%。F₁进一步筛选获得tbx2b杂合突变体,测序结果显示突变类型为11 bp碱基缺失的移码突变。tbx2b杂合子内交获得纯合子,tbx2b纯合突变体在5 dpf死亡并出现早期心脏环化异常表型。斑马鱼整胚原位杂交实验显示在3 dpf tbx2b纯合突变体中, 心脏腔室分化特异性标志基因nppa、nppb表达上调并异位表达在AVC,而AVC发育关键基因has2的表达消失。高效构建tbx2b突变体并初探其对下游基因的影响,为后续深入研究tbx2b对心脏AVC发育的作用奠定了基础,同时加深了人们对早期心脏调控网络的认识。     

ECT 6和ECT 7调控拟南芥开花时间的研究北大核心CSCD

m^(6)A修饰是mRNA上含量最丰富的一种修饰,调控mRNA的命运决定。YT521-B同源性(YTH)结构域蛋白是一类典型的m^(6)A“阅读器”,能识别并结合m^(6)A,完成基因的转录后调控。为了探究拟南芥YTH结构域蛋白ECT6和ECT7的功能及其分子机制,该研究对ect 6、ect 7和ect 6 ect 7双突变体进行基因型和半定量PCR鉴定及开花表型观察,通过细胞学观察分析ECT6和ECT7的亚细胞定位,并采用qRT-PCR检测开花关键基因的表达量。结果显示:(1)ECT 6基因组包含5个外显子和4个内含子,ect 6突变体分别插入在ECT 6基因的第3和第5外显子;ECT 7基因组包含6个外显子和5个内含子,ect 7突变体分别插入在ECT 7基因的第4和第6外显子。(2)突变体ect 6和ect 7均为完全敲除的功能缺失突变体,在长日照下二者均表现出开花提前和叶片数减少。(3)在长日照和短日照下ect6 ect7双突变体均表现出开花提前和叶片数减少。(4)开花抑制基因FLC和成花素基因FT是关键的开花调控因子,qRT-PCR分析结果显示,在ect 6 ect 7双突变体中,FLC的表达水平降低,FT的表达水平升高,且春化通路基因VIN 3、VRN 2、VRN 5和自主通路基因FVE的表达水平也显著升高。(5)ECT6和ECT7均定位于细胞核和细胞质中。     

Fus在斑马鱼生长发育及两性生长异形中的功能

为研究肉瘤融合基因(fus)在鱼类中的功能, 在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9基因突变技术使fus基因产生移码突变。fus-/-纯合突变体斑马鱼发育正常并且完全可育, 但体长和体重在幼鱼和成年阶段都小于野生型斑马鱼。此外, 相较于野生型斑马鱼, fus-/-纯合突变体斑马鱼不存在雌鱼身体比例大于雄鱼的性别异形现象。在fus-/-纯合突变体斑马鱼早期幼鱼发育阶段, 一些生长相关基因包括gh1、ghra、igf1、igf2a、stat5.1和socs6的表达水平显著低于野生型斑马鱼但其运动能力并未受到影响。因此, 不同于fus基因在哺乳动物中的功能, 它在斑马鱼中不参与运动神经元的发育, 但在调节鱼类躯体生长发育与两性生长异形方面有着重要的功能。     

敲除trim47基因斑马鱼脑和脾的比较转录组学分析

用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼(Danio Rerio)的trim47, 收集TRIM47–/–(trim47基因敲除)和WT(野生型)斑马鱼的大脑和脾脏进行RNA-seq分析, 以鉴定差异表达基因(DEGs)。总共确定了271个DEGs, 经过简要分析, 将这些DEGs注释为KEGG途径和GO富集分析, 与WT组相比, TRIM47-/-组的脑中DEGs集中在细胞黏附和谷氨酸能突触信号传导途径中。在脾脏中, 与野生型组相比, TRIM47-/-组的DEGs在补体和凝血级联信号通路中发生了变化。使用qRT-PCR验证了脑和脾中与补体途径相关的基因, 与转录组数据一致。这些结果表明, Trim47在脾脏和大脑中起着重要的生物学作用, 尤其是通过补体途径参与先天免疫功能。体内感染实验表明, trim47基因敲除可提高斑马鱼中鲤春病毒血症病毒(SVCV)的感染率。总之, 这些发现为TRIM成员在先天免疫中的功能提供了新线索。     

fbxo32基因在traf6缺失斑马鱼肝脏中的表达分析

为了进一步研究fbxo32在肝脏相关疾病中的作用, 进行了traf6缺失斑马鱼Danio rerio肝脏的组织切片分析, 结果显示斑马鱼traf6缺失个体表现出明显的肝萎缩特征, 包括肝脏组织结构松散、肝细胞排列不规则及缺少肝脂肪滴等症状。同时荧光定量实验表明fbxo32 mRNA在检测过的野生型斑马鱼组织中均有一定量的表达, 在肝脏中表达量较低而在卵巢中表达量较高。而与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变体斑马鱼肝脏中的表达量上调超过100倍。进一步原位杂交结果显示, fbxo32 mRNA的信号主要集中于肝脏细胞, 而在血细胞中则没有检测到信号。特别是与野生型斑马鱼相比, fbxo32 mRNA在traf6突变型斑马鱼肝脏中的信号明显增强。实验结果表明traf6缺失能引起fbxo32基因的上调表达, 并会导致traf6突变型斑马鱼肝脏发育异常并发生萎缩。     

斑马鱼ftr56基因克隆表达及功能研究

为进一步了解硬骨鱼类特有的finTRIM (Fish novel tripartite motif, ftr)在斑马鱼(Danio rerio)抗病毒天然免疫中的作用, 研究克隆了斑马鱼ftr56基因并分析了其对鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus, SVCV)增殖的抑制作用。根据NCBI中斑马鱼ftr56序列设计引物, 采用PCR方法, 扩增ftr56 CDS区, 连接至真核表达载体pcDNA4.0-His, 构建真核表达质粒pcDNA4.0-ftr56-His, 进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测SVCV感染斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)后ftr56 mRNA的变化。系统进化树分析显示, 斑马鱼FTR56单独聚为一支。氨基酸多序列比对结果显示, 其与黑猩猩、牛、鼠的TRIM56相似度为22%—23%。FTR56二级结构具有1个RING指结构域, 1个B-box结构域, 1个卷曲螺旋结构域和1个B30.0结构域。qRT-PCR检测结果显示, ftr56在SVCV感染后24h表达量显著上升。在过表达ftr56后, SVCV的G蛋白mRNA水平和蛋白水平在12h和24h相比对照组明显减少, 培养基上清中SVCV滴度也明显降低, 表明FTR56抑制SVCV的增殖。实验为进一步揭示finTRIM在鱼类病毒性疾病中的免疫调节机制提供参考。     

斑马鱼elovl8缺失对抗冷胁迫下存活率及脂肪代谢的影响

研究利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼elovl8a-/-、elovl8b-/-和DKO(elovl8a和elovl8b)敲除模型,通过组织学观察、实时荧光定量PCR和脂肪酸组成分析等实验方法,探究了脂肪酸延长酶8(elovl8)缺失对斑马鱼抗冷胁迫能力的影响.结果表明elovl8缺失导致斑马鱼在低温环境下的存...     

ADAM12‐deficient zebrafish exhibit retardation in body growth at the juvenile stage without developmental defects

ADAM (a d isintegrin a nd m etalloprotease) constitutes a family of multi‐domain proteins that are involved in development, homeostasis, and disease. ADAM12 plays important roles in myogenesis and adipogenesis in mice; however, the precise physiological mechanisms are not known, and the function of this gene in other vertebrates has not been examined. In this study, we used a simple model vertebrate, the zebrafish, to investigate the functions of ADAM12 during development. Zebrafish adam12 is conserved with those of mammals in the synteny and the amino‐acid sequence. We examined adam12 expression in zebrafish embryos by whole mount in situ hybridization and the promoter activity of the adam12 upstream sequence. We found that adam12 is strongly expressed in the cardiovascular system, erythroid progenitors, brain, and jaw cartilage during zebrafish development, and adam12‐knockout zebrafish exhibited reduced body size in the juvenile stage without apparent morphological defects. Taken together, these results suggest that adam12 plays a significant role in the regulation of body growth during juvenile stage in zebrafish, although the precise molecular mechanisms await further study.     

团头鲂nanos3基因的克隆鉴定

为了标记团头鲂(Megalobrama amblycephala)的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs), 首次克隆并鉴定了团头鲂nanos3基因(mananos3)。mananos3全长1027 bp, 包括48 bp 5′UTR (5′untranslated Region), 490 bp 3′UTR和489 bp开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)。该基因编码162个氨基酸。通过序列比对发现Mananos3蛋白和其他物种Nanos蛋白一样, 存在一个保守的RNA结合功能域, 该功能域包含一个锌指基序(Motif)。系统发育树结果显示, Mananos3与鲤(Cyprinus carpio)的Nanos3最为相近。半定量和定量PCR结果表明, mananos3具有较高的母源表达, 并在胚胎发育早期高量表达, 而在1000细胞期之后表达量逐渐降低。在成体组织中, mananos3仅在卵巢中检测到表达。mananos3和斑马鱼(Danio rerio) nanos3 (zfnanos3)的3′UTR均可以介导绿色荧光蛋白特异标记团头鲂和斑马鱼胚胎发育早期的PGCs, 但是mananos3的3′UTR能够更特异地标记团头鲂的PGCs。通过比对mananos3和zfnanos3的3′UTR发现, mananos3 的3′UTR中有一个非经典的miR430识别位点(GCACTA)。通过对该位点的突变研究证实其有利于nanos3在非PGCs组织中的降解。综上所述, 团头鲂mananos3的3′UTR序列中的非经典miR430识别位点(GCACTA)可能与介导报告基因在PGCs中特异表达相关。     

基于Cre/loxP系统的睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠模型的构建及敲除效率检测

极长链多不饱和脂肪酸(very long chain polyunsaturated fatty acids,VLC-PUFAs)是哺乳动物视网膜、睾丸等极少数组织中特有的脂肪酸,其生物合成的关键酶为极长链脂肪酸延长酶4(very long chain fatty acid elongase 4,Elovl4)。建立组织特异性敲除Elovl4基因的动物模型有利于深入研究VLC-PUFAs的生物学功能,因此,本研究基于Cre/loxP系统,先分别构建了Stra8-Cre小鼠和Elovl4 floxed小鼠,通过杂交获得(Elovl4[flox/+],Stra8-Cre)杂合子基因敲除小鼠,再选择雌鼠与Elovl4 floxed纯合子雄鼠即Elovl4 [flox/flox]雄鼠杂交,通过基因型鉴定筛选获得(Elovl4[flox/flox], Stra8-Cre)纯合子小鼠。利用RT-PCR、qRT-PCR、Western blotting、免疫组化和免疫荧光检测Elovl4在睾丸组织中的敲除效率,结果表明,无论是杂合子还是纯合子基因敲除小鼠,其睾丸组织中Elovl4的表达在mRNA及蛋白水平显著下调,但其他组织未受影响。本研究成功构建了睾丸组织特异性敲除Elovl4基因小鼠,为后续研究VLC-PUFAs对雄性小鼠生殖功能的影响及相关分子机制提供可靠的动物模型。     

类球红细菌XR12的分离、鉴定及其解毒效果研究

为丰富敌百虫污染治理的微生物资源, 从养殖污泥中分离筛选了一株优良的敌百虫耐受菌XR12, 综合生理生化特性与16S rRNA序列分析对其进行了鉴定, 采用纸片扩散法分析了其耐药性, 并进一步评价了其安全性与解毒效果。结果显示: 菌株XR12对敌百虫的最大耐受浓度达到了7680 mg/L。通过生理生化特性以及16S rRNA序列分析, 菌株XR12被鉴定为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides), 其16S rRNA序列与GenBank中类球红细菌菌株的16S rRNA序列有98%—100%的同源性, 而且与类球红细菌菌株RSF1 (登录号: KF606891)的亲缘关系最近。此外, 菌株XR12对卡那霉素、罗红霉素、吡哌酸、阿莫西林、氟苯尼考、多黏菌素B、新霉素、庆大霉素、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、链霉素、四环素、奈替米星等抗生素高度敏感, 对多西环素中度敏感, 对杆菌肽、萘啶酸、磺胺异噁唑等抗生素耐药, 对斑马鱼的LC₅₀大于109 cfu/mL, 能够将敌百虫对斑马鱼的LC₅₀从26.06 mg/L增加至59.51 mg/L, 对敌百虫具有良好的解毒效果。研究证实了类球红细菌XR12的安全性及其对敌百虫良好的解毒效果, 对养殖水体中敌百虫的解毒具有潜在的应用价值。