农杆菌介导的雪花莲凝集素基因转入玉米骨干自交系

以农杆菌AGL0介导,将雪花莲凝集素基因转入玉米骨干自交系齐319和掖515胚性愈伤组织细胞,从筛选后的抗性愈伤组织获得再生植株。农杆菌浓度和共培养时间均能显著影响侵染后玉米愈伤组织的抗性频率。在农杆菌浓度OD600 0．2～0．3,共培养时间3d时,侵染后玉米愈伤组织的抗性频率最高,平均约4％。对再生植株及其子代基因组DNA的PCR及Southern杂交分析表明雪花莲凝集素基因已经整合到玉米基因组中,并遗传给后代。在蚜虫人工接种试验中,转基因植株上蚜虫的繁殖力为非转基因对照植株上的50％,这表明转基因植株抗蚜性显著增强。     

农杆菌介导的玉米转化后分化和生根条件优化

通过诱导5种自交系玉米授粉10～12d的未成熟幼胚,产生胚性愈伤组织,以农杆菌介导法,分别转化‘18-599(H)’、‘齐319’、‘综31’、‘Z674’和‘郑58’等5种玉米自交系。以GUS基因作为报告基因进行组织化学染色和潮霉素磷酸转移酶基因片段PCR特异扩增等方法检测都证明了外源基因的成功转化。对5种自交系玉米的出愈率、抗性愈伤率、转化率等指标进行了详细统计,并对分化培养基中附加不同细胞分裂素的分化效果以及对不同生根培养基的生根效果进行比较、优化,结果发现,通过优化抗性愈伤的最佳分化培养基(N6 1.0mg·L-1KT)和最佳生根培养基(1/2MS),使‘18-599(H)’的转化效率最高达6.1%,‘齐319’次之为3.5%。     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(ZeamaysL.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt基因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长。Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致。     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(Zea mays L.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株.经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株.农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响.外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律.耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长.Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致.     

番茄红素β-环化酶基因的玉米转化及 后代遗传分析

利用农杆菌介导法将番茄红素β-环化酶基因(Lycb)转入由玉米自交系天塔五号植株,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在27株T0转基因植株中,PCR初步检测后8株呈阳性;将T1代转基因植株以株系为单位用200mg/L草铵膦抗性筛选后,收获抗性植株种子。T2代转基因植株进一步进行PCR、RT-PCR和田间草铵膦涂抹检测,结果表明,PCR、RT-PCR为阳性的6个株系植株均具有草铵膦抗性。选取6株阳性植株提取叶片总类胡萝卜素,经HPLC分析其β-胡萝卜素含量显著高于野生型,表明目的基因Lycb成功的转入玉米,并得到了稳定遗传。     

影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素

以我国玉米骨干自交系9046,齐319,414,Mo17的幼胚为材料,在已经建立的农杆菌介导的玉米幼胚转化体系的基础上,研究了影响农杆菌介导玉米优良自交系遗传转化的因素,建立了优化的玉米优良自交系的遗传转化体系.研究结果表明,1.0-2.0mm的玉米幼胚是最适宜的转化受体;在感染液和共培养基中都加入乙酰丁香酮(200μmol/L)和抗坏血酸(50mg/L),能显著提高农杆菌对玉米的侵染能力;而感染前将幼胚高渗透压预处理未能提高转化率;延迟筛选有利于提高抗性愈伤组织的存活率.应用优化后的转化体系,获得了这4个玉米优良自交系的转基因植株,PCR阳性植株率为1.71%-4.09%.转化植株叶片总DNA的PCR和Southern杂交分析表明,T-DNA上的外源基因已经整合进了玉米基因组,并且在大多数转基因植株(71.4%)中为单位点插入.这一体系的建立,为进一步将有用基因导入玉米优良自交系奠定了基础.     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

转MDMV CP基因玉米植株的再生

用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因导入玉米自交系综31幼胚诱导的愈伤组织中,在含有Bialaphos 6 mg·L^-1的选择培养基上经过3个月的抗性筛选,抗性愈伤组织在分化培养基上生成可育再生植株。PCR、PCR-Southern blot及DNA点杂交结果表明,外源基因已导入到玉米基因组中。转基因T1和T2代植株在大田表现出对MDMV的抗性,可以降低发病率,减轻发病程度。     

农杆菌介导抗储粮害虫转基因小麦(Triticum aestivum L.)的获得及分析

以本实验室选育的小麦优良品系的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导将抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI转入小麦培养细胞,经筛选获得抗卡那霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR和实时PCR检测、PCR-Southern和Southernblot验证,确定了3株独立再生植株为含有CpTI的转基因植株。农杆菌菌浓度、侵染时间及转化处理方式对小麦转化率均有明显影响。3株转基因植株正常可育并结籽,形成转基因株系。外源基因在转基因植株T1代中的分离呈多样性,部分株系(转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ)表现出孟德尔遗传规律。抗虫试验表明,3株转基因植株T2代籽粒对储粮害虫麦蛾具有一定的抗性,转基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ及非转基因植株的T2代籽粒虫蛀率分别为19·8%、21·9%、32·9%和58·3%。转基因植株T1代群体农艺性状调查显示,3个株系具有良好的农艺性状,为小麦的遗传改良提供了新的种质抗虫材料。     

利用微滴数字PCR方法快速分析转基因玉米中外源基因的拷贝数

以玉米自交系501幼胚为受体材料,首先将来自球形节杆菌的EPSPS基因(G23V)按玉米密码子偏爱性进行优化与人工合成,并且将其克隆到表达载体pBAC9200中;然后利用农杆菌介导法将质粒载体转入玉米自交系501的幼胚中。经过愈伤诱导、草甘膦抗性筛选和分化培养最终获得14株转化再生植株。经PCR、RT-PCR检测表明,其中5株目的基因G23V-EPSPS稳定整合且在转录水平获得表达。随后,利用微滴数字PCR技术对外源基因拷贝数进行了检测分析,分析结果表明在5株阳性转基因植株中,外源基因G23V-EPSPS拷贝数分别为0.12、1.0、0.9、1.89和0.66,介于0~2之间。成功建立了草甘膦抗性基因G23V-EPSPS在玉米中的遗传转化体系,为以新型高抗草甘膦G23V-EPSPS基因作为转基因玉米筛选标记基因奠定了基础;而且以微滴数字PCR技术代替传统的Southern Blot简便快速的完成外源基因拷贝数的分析,为微滴数字PCR技术在转基因外源基因拷贝数检测上的广泛应用做了初步的探索。