麦类作物遗传转化(英)

麦类作物包括小麦 (TriticumaestivumL .)、硬粒小麦 (Triticumturgidumconv .durumDest.e.m)、大麦 (HordeumvulgareL .)、黑麦 (SecalecerealL .)、燕麦 (AvenasativaL .)及小大麦 (×TritordeumAschersonetGraebuer.)。自从基因枪被发明以来 ,科学家们已经利用来自麦类作物的幼胚、盾片、成熟种子胚、花粉粒、花药、幼穗、叶基组织、发芽种子幼苗的顶端分生组织及其愈伤组织或培养物作为外植体 ,通过基因枪、农杆菌介导、PEG法、电激法、微注射法、硅化纤维素介导、幼穗注射法等技术先后将一些选择标记基因、报告基因和有用的目的基因如抗真菌、抗虫、籽粒品质、抗干旱基因等转化到麦类作物中。转基因植物表现为抗性增强或籽粒的加工品质提高和营养成份增加。被转化的基因通常以单位点多拷贝的形式随机整合到受体细胞的基因组中 ,并以孟德尔规律遗传。整合位点一般分布在染色体的近端粒区域 ,整合的拷贝数大多为 5～ 10个拷贝 ,最高可达到 5 0个拷贝。在转化过程中 ,被转化的质粒上的片段包括选择标记基因、目标基因、甚至质粒的抗生素基因和其他无关序列 ,随机地连接并形成多个分子量大小不等 ,组成成分不同的分子簇 ,或首先由其中一个分子簇整合到植物基因组中 ,这会导致在整合位点附近产生“热点     

无载体主干序列的bar和cecropin B 基因表达框共转化水稻

基因枪等直接转化法可将去除质粒载体主干序列的外源基因表达框导入植物基因组,消除质粒主干序列对植物基因组的影响,同时由于转基因分子较小,比较容易实现多个基因的共转化,在植物基因工程育种上有重要的应用价值,研究了基因枪介导外源基因表达框（包括启动子、基因开放阅读框和终止子）转化水稻的影响因素和转基因的整合模式,结果表明：（1）基因枪介导外源基因表达框转化水稻的频率约在0.1%～0.5%之间,非选择标准基因与选择标记基因的共转化频率约为50%～60%,增加基因表达框DNA浓度可提高转化率。相同基因构建物对不同品质水稻的转化率不同,基因构建物的侧边序列对基因枪转化的品种差异可能具有重要影响。（2）非选择标记基因cecropin B表达框在水稻基因组内整合模式简单,仅有1～3个拷贝;筛选标记基因bar表达框却比完整质粒转化后的整合模式复杂得多,插入拷贝数在4～14个之间,线形基因表达框的游离DNA末端和CaMV 35S启动中子重组热点介导的转基因重组可能是导致bar基因表达框复杂整合的重要原因。     

基因枪转化的bar基因表达盒在水稻中遗传行为复杂

基因枪介导基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)转化是基因枪转化植物的新趋势,它能消除质粒载体主干序列对转基因植物的不利影响。本文研究了基因枪转化的bar基因表达盒在转基因水稻T1～T3世代中的遗传行为。结果发现:作为筛选标记的bar基因表达盒在水稻基因组中多拷贝整合,遗传分离行为复杂,还出现了Basta抗感分离比在35:1～144:1之间的"假纯合体",但50%转基因株系中(5/10)bar基因可作为一个显性基因按孟德尔方式稳定遗传至自交T2代。虽然bar基因为多拷贝整合,30%的转基因株系(3/10)在自交低世代(T1)能获得纯合体。Southern杂交分析发现,多拷贝的bar基因表达盒倾向于连接成转基因串联子整合在水稻基因组内。我们发现在Basta抗性正常分离的株系后代中bar基因表达盒Southern杂交模式能稳定遗传,但异常分离的株系后代中bar基因表达盒的一些拷贝发生了丢失。我们推测,bar基因表达盒在水稻中遗传分离行为的复杂原因可能是bar基因表达盒多拷贝整合、基因丢失和基因表达互作。     

三个方便实用的植物表达载体构建与验证

为满足植物功能基因组学研究及转基因安全性需要,本研究根据一些国内外引进或商业化的植物表达载体及其相关元件,构建了3个适合于植物,尤其是单子叶植物转化的表达载体,即p AH006、p WMB022和p WMB025。p AH006载体包含由玉米泛素ubi启动子调控的GUS基因和bar基因的完整T-DNA区域,此区段能够被酶切回收,可用于单子叶植物农杆菌介导转化效率评价及基因枪介导线状DNA转化效果研究;p WMB022载体携带由双35S启动子调控的玉米色素基因Lc和C1,可用作基因枪介导的共转化筛选标记,直观筛选含目标基因转基因材料;p WMB025载体携带由ubi启动子调控的、商业化转基因植物中广泛利用的EPSPS基因,可用于禾谷类作物农杆菌或基因枪介导的遗传转化,载体多克隆位点可通过酶切方式更换目标基因。酶切鉴定结合农杆菌或基因枪介导的小麦幼胚愈伤组织或叶片转化验证此3个载体表明,载体构建正确,其标记基因、可视化基因和报告基因均能正常表达。这3个载体的构建对于小麦等植物转化效率提升、安全型转基因作物获得和植物功能基因组学研究等具有重要意义。     

植物中转基因的整合机制

转基因在植物基因组中的整合分两步:在整合前阶段,转化的完整质粒及转基因片段经重组连接形成转基因串联子(transgenearray),其中不含任何植物基因组序列,连接反应由植物细胞本身的酶催化,仅依赖于游离的DNA末端,CaMV35S启动子和TDNA边界序列中的特定序列可能充当重组热点;在整合阶段,转基因DNA通过微同源介导的异常重组整合到植物基因组中,最初的整合位点作为整合热点,引导随后的转基因分子在该位点附近整合,不同转基因位点可被1～10kb植物DNA隔开,形成转基因簇(transgenecluster)。     

利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗

利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T₁代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T₁代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。     

转基因植物中T-DNA整合的分子特征及表达

植物中不同转基因方法转化外源基因的T-DNA整合特征既具有共性,又具有特性,使得转基因的遗传在各独立转化体间呈现多样性,另外多种遗传因子和限制因素使受体植物中外源基因的表达存在下降,甚至出现基因沉默等复杂现象。本文主要对农杆菌介导及裸露DNA直接转化转基因植物中T-DNA的分子特征和转基因表达的影响因子进行了介绍和概述。转化体中转基因的遗传稳定性和表达主要取决于转基因在植物基因组中的整合位置、拷贝数及组成结构。因而,通过对具有表达水平各异的转化体进行深入的遗传分析和分子生物学研究以及转化体之间进行的比较研究,将对转基因技术自身的完善、定点整合以及更有效的利用转基因技术都具有十分重要的意义。     

抗菌肽B基因导入水稻及转基因植株的鉴定

构建了一个适合在水稻中表达的含有抗菌肽B基因的转化载体(pCB1),应用基因枪转化法将其导入水稻未成熟胚,获得了一些转基因水和植株.Basta抗性鉴定,抗菌肽B基因PCR扩增分析,点渍印迹和Southern印迹分析结果表明,选择标记基因(bar)和抗菌肽B基因都已整合入转化水稻基因组中,Northern印迹分析证实了抗菌肽B基因在RNA水平上的表达.转基因水稻植株增强了对水稻白叶枯病和细条病的抗性.     

一种新的用于删除选择标记基因的Cre/lox系统

设计了一种新的诱导型Cre/lox系统,并在转基因烟草(Nicotianatabacum L.)中进行了验证.在诱导剂的作用下,位于同向lox位点之间的选择标记基因(hpt)和重组酶基因(Cre)在烟草愈伤组织中被删除.在该系统中,Cre基因在玉米乙酰苯胺类化合物诱导启动子(In5-2)的控制下表达.对转基因后代的分子检测结果表明,不论是否加入了诱导剂,目的基因(gus)均被整合到烟草基因组中;在诱导剂处理的48株转基因烟草To代中,45株的hpt基因被删除了.该系统只使用一个载体,克服了二次转化系统带来的问题.     

根癌农杆菌介导小麦幼胚遗传转化的影响因素

利用携带pC3301质粒(含bar和gus基因)的超毒根癌农杆菌菌株EHA105对普通小麦(Triticum aestivum L.)扬麦158进行了遗传转化,对筛选中的抗生素浓度、菌液浓度、共培养温度和时间、幼胚预培养时间、乙酰丁香酮(AS)浓度、洗涤用液及筛选方式等影响转化的几个重要因素进行了讨论.对从294个小麦幼胚外植体中转化得到的5株成活植株进行了PCR和Southern blot分析,结果表明其中2株小麦基因组中整合了外源DNA,转化频率为0.68%.     

麦类作物小孢子培养与遗传转化研究进展

小孢子作为单个单倍体细胞,通过诱导培养能再生成纯合的二倍体植株,不仅为分子生物学、遗传学、形态发生学研究提供稳定的材料,也对小麦等作物的转基因研究提供新方向和新思路。本文主要介绍麦类作物小孢子培养的基本步骤及关键因素,简要介绍了以小孢子为材料进行小麦基因遗传转化的方法。     

主要农作物转基因研究现状和展望

近15年来,大豆、水稻、玉米、小麦等主要农作物转基因研究取得了较大进展,几乎各种遗传转化方法在这些作物上都取得了成功,尤其是农杆菌介导法,不仅在难转化的双子叶作物大豆上取得了成功,而且在单子叶作物水稻、玉米、小麦上先后取得了突破。同时,将一些与重要性状改良有关的外源基因转入了主要农作物,包括抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆、品质改良、发育调控、营养吸收等。转基因大豆、玉米、棉花、油菜在生产上得到了大面积种植,产生了极大的经济效益,2004年全球转基因作物的种植面积达到了8100万公顷。本文对大豆、玉米、水稻和小麦等主要农作物转基因研究历史和产业化现状进行了综述,并对主要农作物转基因研究中存在的问题进行了分析。     

小麦族遗传资源的多样性及其保护

禾木科小麦族中包含了三种世界最重要的粮食作物,即：小麦、大麦和黑麦以及许多具有重要经济价值的牧草种类。小麦族植物种类繁多、分布广泛、生态多样,具有极其丰富的形态和遗传变异类型。作为巨大的基因资源库,小麦族植物在通过现代生物技术而导入外源有益基因的麦类作物育种程序中,具有重要和特殊的价值。然而对于小麦族植物的生物多样性的研究和了解还远远不足。同时在全球环境的不断改变和遭到破坏的今天,一些小麦族的物种已处于濒危的状态而面临灭绝,因此对于小麦族丰富的遗传多样性制定有效的措施进行保护是摆在我们面前亟待解决的课题。     

高粱遗传转化研究进展

高粱是世界上仅次于小麦、水稻、玉米和大豆的重要作物之一,然而由于其高效、稳定的遗传转化体系的建立较难,限制了其转基因研究进程.近年来,随着转基因技术的不断发展和完善,高粱转基因研究也取得了飞速的发展.从高粱遗传转化再生系统中外植体的选择、转化方法、影响转化和基因表达效率的因素等几方面进行了综述,并总结转基因高粱研究进展.     

小麦遗传转化研究进展

小麦作为最重要的3大禾谷作物之一,其离体培养具有很强的惰性,再生频率与水稻、玉米相比要低一些,目前大多通过对基因型和外植体的选择来达到植株的高频再生分化,因此其遗传转化就远远滞后于水稻和玉米,更不用说与其它双子叶植物相比了.重点综述了小麦转基因技术和外源基因在小麦中的遗传转化研究现状,其内容包括几种主要的小麦转基因方法和以基因枪法为主的各种转化技术对品质基因、抗除草剂基因和抗病等基因在小麦中的遗传转化研究进展,并对存在的一些问题进行了简要的论述.     

Resistance to biotic and abiotic stress in the Triticeae

Poverty, hunger and malnutrition occur in many parts of the world despite the enormous progress that has taken place in agriculture and food production in the last century. It is estimated for wheat, that by 2020 the world will require a 60% increase in production to meet the projected requirement. Resistance to both biotic and abiotic stresses will be critical in reaching this goal. Distinct advantages accompany the use of genetic resistance to biotic and abiotic stresses. The most important advantage is the fact that response to the stress situation occurs independently of the managerial ability, skill and resource level of the producer. Anyone can use a stress resistant crop. Immense progress has been made in the field of functional genomics and molecular manipulation. It is clear that the restraining factor in future will not be the availability of scientific techniques and tools, or for that matter, genetic resources; but the human and financial capacity to achieve the goals on a world-wide scale so that they really do make a difference to the livelihood of the poor. Triticeae form a meaningful proportion of staple and non-staple food crops around the world. To achieve world-wide food security in the future, Triticeae with resistance to stresses will have to play a major role. The future demands crops with stable yield irrespective of environmental constraints, good quality and a high nutritional value; crops that are free of pesticide residues and other harmful substances.     

Age-dependent transformation frequency in elite wheat varieties.

Wheat is a major world crop and as such is a primary target for improvement of agronomic characteristics via genetic engineering. Optimization of transformation is essential in order to overcome the relatively low transformation frequencies encountered with wheat. Transformation of elite wheat varieties is not always successful due to variability in regeneration and transformation frequencies between varieties. In this work, two elite wheat varieties with a relatively high embryogenic capacity were transformed by particle bombardment. A strong correlation between transformation frequency and the age of wheat donor plants was observed in both varieties. The mean transformation frequency rose from 0.7% to 5% when using immature embryos from old and young donor plants, respectively. This was observed in both varieties, the best bombardments achieving up to 7.3% frequency. Using explants at an optimal developmental stage from donor plants grown under environmentally-controlled conditions has improved the reproducibility of transformation efficiency of elite wheat varieties and leads to the production of apparently phenotypically normal, fertile, transgenic plants.     

短柄草与麦类作物的比较基因组学研究进展

麦类作物是人类主要的食物来源,其遗传改良对于保障世界粮食生产具有重要作用。获得麦类作物的基因组和功能基因组信息是作物遗传育种学家解析种质资源高产及抗逆机理,并准确选择目标性状、实现分子设计育种目标的有效途径。目前,二穗短柄草（Brachypodium distachyum）是早熟禾亚科中唯一完成全基因组测序的植物。以二穗短柄草为模式植物,利用比较基因组学方法获得早熟禾亚科中基因组庞大而复杂的麦类作物的相关信息,必将加速麦类作物的遗传改良进程。本文重点介绍近十年来短柄草在麦类作物比较基因组学方面的研究进展。     

质粒DNA物理形态和其它因素对获得可育转基因小麦的影响

本工作分析了不同形态质粒DNA和未成熟胚高渗透压处理对基因枪小麦转化体系的适用性.高渗处理对瞬间表达和转基因小麦的再生均有明显的促进作用.轰击之前对质粒DNA进行变性处理导致瞬间表达反应大幅度下降,但稳定转化频率(指从100个轰击未成熟胚得到的再生可育转基因植株数)与双链DNA相差不大.使用单链质粒DNA、线性双链质粒DNA和环状双链质粒DNA均可以得到转基因小麦植株.迄今已得到26个不同的转基因冬小麦株系和4个不同的转基因春小麦株系.这些转基因小麦大多数已产生种子,几个春小麦株系已获第二代种子.