Th2型γδ T细胞参与急性RSV感染所诱发的气道炎症反应

γδ T细胞是机体重要的固有免疫细胞,参与肺组织炎性病变及哮喘的发生发展。但迄今为止,γδT细胞在呼吸道合胞病毒感染所诱发的气道炎症反应中的作用尚不十分清楚。研究通过建立RSV急性感染的实验动物模型,采用HE染色、Real-timeRT-PCR、流式细胞术等实验方法,旨在揭示γδT细胞在感染性气道炎症发生中的作用及其相关作用机制。结果显示,RSV感染导致BALA/c鼠肺炎性细胞浸润,其中嗜酸性粒细胞增加明显;同时肺组织局部Th2型细胞因子IL-4、IL-13 mRNA表达升高;RSV感染后,肺组织γδT细胞总数,特别是活化的CD69+γδT细胞数量显著增加,其中分泌Th2型细胞因子IL-4和IL-13的γδT细胞数量增加明显,而分泌Th1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞数量显著减少,证实γδT细胞通过分泌Th2型细胞因子介导RSV感染诱发的气道炎症反应。     

天然辅助细胞及其对相关疾病影响的研究进展

天然辅助细胞(natural helper cell,NHC)是一种近期发现于鼠体内的2型固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs2)。NHC起源于骨髓淋巴系祖细胞,由iNH细胞分化而来,且处于分化终末阶段。这些细胞主要位于腹腔内的脂肪相关淋巴簇(fat-associated lymphoid cluster,FALC)与肺组织中,在其形态及特征方面,与淋巴细胞具有相似性。其表面高度表达-kit、sca-1、IL-7R,而缺乏lineage标记。经过不同刺激信号的作用,NHC可产生相应的Th2型细胞因子,如IL-5、IL-6与IL-13,进而调节IgA抗体的产生并辅助B1细胞自我更新。NHC分泌的大量IL-5和IL-13可促进嗜酸性粒细胞与杯状细胞的增生,同时促进黏液分泌,参与过敏反应及呼吸道炎症的发生并在抵抗寄生虫感染的过程中发挥关键作用。     

呼吸道合胞病毒感染诱导BALB/c鼠固有免疫细胞分泌IL-33

IL-33是新发现的细胞因子,在病毒感染所诱发的气道炎症反应中发挥重要作用。研究发现感染呼吸道合胞病毒的BALB/c鼠肺组织内IL-33水平明显升高。但RSV感染后分泌IL-33的免疫细胞类型,尤其是感染早期分泌IL-33的固有免疫细胞类型目前尚不清楚。通过分离培养BALB/c鼠肺泡巨噬细胞及树突状细胞,采用ELISA及实时荧光定量PCR法检测上述固有免疫细胞RSV感染后IL-33分泌水平的变化。结果显示,RSV感染72 h后BALB/c鼠肺泡巨噬细胞IL-33mRNA水平明显升高,而树突状细胞RSV感染24 h后IL-33mRNA水平开始上升,48 h达峰值。研究证实RSV感染诱导BALB/c鼠固有免疫细胞分泌IL-33,进而介导感染后炎症的发生发展。     

OX40参与RSV气道炎症反应中CD4~+T细胞的增殖活化

OX40是TNFR超家族成员之一,主要表达于活化的CD4~+T细胞表面。OX40能促进CD4~+T细胞的增殖与活化,但其在呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytial virus, RSV)感染所诱发的气道炎症反应中对CD4~+T细胞增殖与活化的作用尚不十分清楚。通过建立RSV急性感染的实验动物模型,采用流式细胞术、免疫磁珠分选、Real-time RT-PCR、Elisa、Western Blot等实验方法,旨在揭示在RSV感染性气道炎症中OX40对CD4~+T细胞增殖与活化的影响作用。结果显示,RSV感染后脾组织内表达OX40的CD4~+T细胞数量及CD4~+T细胞OX40 mRNAs和OX40蛋白表达水平显著增加。从感染3 d的BALB/c鼠脾组织分选CD4~+T细胞进行体外培养并加入OX40激动型抗体,发现加入OX40激动型抗体的CD4~+T细胞组与未加组相比,其细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-13的表达水平显著增高。证实在感染性气道炎症中OX40对CD4~+T的细胞增殖与活化起着重要的调控作用。     

乳腺癌肺转移过程中Th1/Th2型细胞因子的动态变化

探究乳腺癌肺转移模型鼠肺组织内Th1/Th2型细胞因子的动态变化。利用皮下接种或尾静脉注射乳腺癌细胞系-4T1细胞的方式,建立乳腺癌肺转移模型。在4T1细胞接种后第7、14、21天分离模型鼠肺组织,通过HE染色、墨汁染色确认模型建立成功后,提取肺组织总RNA,采用Real-time RT-PCR方法,检测肺组织内IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13表达水平的变化。结果显示,尾静脉注射4T1细胞的BALB/c鼠,肺组织内Th1型细胞因子水平呈现先升高后逐渐下降的趋势;而皮下接种4T1细胞的BALB/c鼠,其肺组织内Th1型细胞因子水平一致处于较低水平。与Th1型细胞因子不同,肺组织内Th2型细胞因子水平无论在皮下接种鼠亦或是尾静脉注射鼠均表现为逐渐升高趋势。结果表明,乳腺癌肺转移过程中出现Th1/Th2型细胞因子失衡,并且由刚开始的Th1优势应答逐渐转变为Th2优势应答。     

人IL-37b转基因对小鼠哮喘模型作用的研究

目的通过研究人抑制性细胞因子白细胞介素37b(interleukin 37b, IL-37b)转基因(transgenic, TG)小鼠(Il37b TG)对卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的哮喘气道高反应性、气道炎症和气道重塑等指标的变化,以及IL-37b在体外对小鼠和人肺结构细胞的作用,评估IL-37b在治疗哮喘方面的潜在意义。方法采用野生型和Il37b TG的雌性C57BL/6小鼠,建立周期为24 d的OVA诱导的哮喘小鼠模型,检测其肺力学参数、炎性细胞分类和Th2细胞因子表达以及肺组织病理学改变。体外采用原核细胞表达系统,获得大量纯化的重组人IL-37b。继而分别预处理小鼠肺成纤维细胞系(MLg)和人肺泡上皮细胞系(A549细胞),随后加以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激,收集培养上清,采用双抗体夹心ELISA检测炎性细胞因子IL-6含量。结果与野生型OVA模型组相比,Il37b TG OVA组的气道高反应性降低,差异有统计学意义(P=0.000 1,P0.05);支气管肺泡灌洗液和肺组织中嗜酸性粒细胞数量降低,差异有统计学意义(分别为P=0.000 1和P0.000 1,P0.05);肺组织炎症细胞浸润明显减少,气道炎症、杯状细胞增生和黏液分泌均明显减轻,苏木精-伊红染色和过碘酸-希夫染色评分也有所降低,差异有统计学意义(分别为P=0.000 1和P=0.000 2,P0.05),马松染色显示急性期胶原沉积的改变不明显;肺组织匀浆中Th2型细胞因子IL-5和IL-13的含量均有所降低。同时研究采用原核细胞表达系统得到的IL-37b预处理鼠肺成纤维细胞MLg和人肺上皮细胞A549,可以降低LPS所诱导IL-6的产生。结论 IL-37b可能通过对相关靶细胞的负向调控进而发挥对哮喘气道的高反应性及气道炎症的抑制作用,为IL-37b作为一种新的治疗方法在临床治疗哮喘的潜在应用提供了一定的实验依据。     

婴儿型双歧杆菌对哮喘小鼠气道炎症的作用研究

目的探讨婴儿型双歧杆菌对气道过敏小鼠的气道炎症作用及其机制。方法 6周龄BALB/c雄性小鼠40只,随机分为4组:阴性对照组、哮喘组、婴儿型双歧杆菌预防组和婴儿型双歧杆菌治疗组。哮喘组、预防组和治疗组用卵清蛋白(Ovalbvmin,OVA)进行致敏和激发诱发哮喘,阴性对照组用生理盐水进行致敏和激发。预防组第0至14天灌胃菌液;治疗组第15至28天灌胃菌液;阴性对照组和哮喘组全程灌胃生理盐水作对照。观察小鼠气道过敏表现;计数肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中细胞总数评估气道炎症程度;肺组织行HE染色;ELISA法测定血清中IL-10、OVA特异性IgE和OVA特异性IgG1的浓度以及肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ的浓度。结果 (1)哮喘组小鼠在激发后出现搔抓口鼻、竖毛、打喷嚏、腹肌扇动、弓背直立、二便失禁以及体重下降等表现,预防组和治疗组的症状较轻。(2)预防组和治疗组BALF细胞数量明显低于哮喘组(P0.05)。(3)肺组织HE染色后,哮喘组小鼠肺组织出现明显的炎症细胞浸润,预防组和治疗组肺组织炎症明显减轻。(4)预防组和治疗组血清OVA特异性IgE浓度明显低于哮喘组(P0.05),并且预防组低于治疗组(P0.05);治疗组血清OVA特异性IgG1浓度明显低于哮喘组和预防组(P0.05);预防组和治疗组血清IL-10浓度明显高于哮喘组(P0.05),且治疗组高于预防组(P0.05);(5)预防组和治疗组肺泡灌洗液中IL-4、IL-13含量明显低于哮喘组(P0.05);IL-5、IL-10、IFN-γ各组浓度都较低,未测出有效浓度。结论口服婴儿型双歧杆菌可以减轻过敏症状,降低肺组织炎症浸润程度,抑制Th2免疫反应。     

IL-23/Th17轴在变应性哮喘中的研究进展

变应性哮喘是一种由辅助性T细胞（T helper cell,Th cell）调节的慢性炎症性疾病。Th1/Th2的失衡一直被认为是变应性哮喘的发病机制,Th2细胞及其分泌的细胞因子白介素4（interleukin 4,IL-4）、IL-5以及IL-13在变应性哮喘特异性症状的发病中发挥重要作用。最近研究发现Th17细胞及其分泌的IL-17参与变应性哮喘的发展过程,IL-23在Th17细胞维持生存和功能成熟中发挥重要作用,并参与抗原诱导的气道炎症反应。该文对目前IL-23/Th17轴在变应性气道炎症反应中的研究进展作一综述。     

香菇多糖对急性弓形虫感染小鼠Th应答调节作用的实验研究

目的 探讨香菇多糖(Lentinan,Lent)对急性弓形虫感染小鼠BALB/c Th1/Th2免疫应答调节效应的影响.方法 对RH强毒株感染的BALB/c小鼠进行不同时间点的香菇多糖预处理,动态观察用药后各组感染小鼠的生存率;在感染后第0、3、5、8和10天提取小鼠的脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-10的分泌水平.结果 感染前6 d 1 mg/kg LNT用药组与药物未处理组相比显著提高了生存率;显著增强了Th1免疫应答中关键细胞因子IFN-γ和Th2免疫应答中关键细胞因子IL-10的分泌水平.结论 对急性弓形虫感染的BALB/c小鼠采用香菇多糖预处理之后能有效激发Th1/Th2型免疫应答的有效建立,对于抵抗弓形虫感染具有重要意义.     

吡虫啉对水稻体内条纹病毒的胁迫效应

水稻条纹叶枯病为灰飞虱(SBPH)传播的一种病毒病,前些年在长江流域尤其江苏地区暴发成灾.为探讨杀虫剂吡虫啉对水稻体内条纹病毒(rice stripe virus,RSV)的胁迫效应,本研究模拟大面积生产上的用药方式,在灰飞虱传毒48 h后对稻苗分别施药1、2、3和4次(以B₁、B₂、B₃和B₄表示),以实时荧光定量PCR(real-time PCR)和蛋白免疫印痕(Western blotting, WB)等方法对稻苗中RSV NS3、CP、SP、NSvc4等4种基因的表达和CP、SP两种蛋白的含量进行分期检测.结果表明: 1)吡虫啉影响4种基因的表达,且其影响程度与施药强度及基因类型有关:有3个处理NS3基因表达水平上调,其中施药4次、接虫后16 d\[以(B₄, 16 d)表示,下同\]的表达水平最高,达10.86,其他处理的NS3基因表达都明显受到抑制.几乎所有B₂和B₃处理都使CP、SP和NSvc4基因的表达受到明显抑制,其相对表达水平为0～0.74;而B₁和B₄的一半处理明显促进其上调,其中(B₁, 16 d)和(B₄, 16 d)SP基因的表达量最高,分别为258.89和730.54.2)吡虫啉对CP、SP基因和CP、SP蛋白表达模式的胁迫效应不同,如(B₁, 19 d)CP基因几乎没有表达(0),但其相应的CP蛋白却明显上调(23.08)
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RT—PCR技术检测呼吸道合胞病毒RNA方法的建立

为了建立一种快速诊断呼吸道合胞病毒（RSV）感染的方法,根据RSVN基因的核苷酸序列,设计合成了一对引物,经RT-PCR扩增,可检出RSVRNA该引物不能检测流感病毒、副流感病毒RNA。应用该法可检出疑为RSV感染的婴幼儿鼻咽分泌物中的病毒RNA且比病毒分离法敏感,特异性与免疫荧光法一致。结果表明RT－PCR法具有快速、敏感、特异的优点,可用于RSV感染患儿的临床诊断。     

Discovery of novel benzothienoazepine derivatives as potent inhibitors of respiratory syncytial virus

The development of novel non-nucleoside inhibitors of the RSV polymerase complex is of significant clinical interest. Compounds derived from the benzothienoazepine core, such as AZ-27, are potent inhibitors of RSV viruses of the A-subgroup, but are only moderately active against the B serotype and as yet have not demonstrated activity in vivo. Herein we report the discovery of several novel families of C-2 arylated benzothienoazepine derivatives that are highly potent RSV polymerase inhibitors and reveal an exemplary structure, compound 4a, which shows low nanomolar activity against both RSV A and B viral subtypes. Furthermore, this compound is effective at suppressing viral replication, when administered intranasally, in a rodent model of RSV infection. These results suggest that compounds belonging to this chemotypes have the potential to provide superior anti-RSV agents than those currently available for clinical use.     

抗呼吸道合胞病毒免疫核糖核酸免疫活性的研究

本文在小鼠模型系统中,应用ELISA和~(125)IUdR释放试验分别研究抗呼吸道合胞病毒免疫核糖核酸(RSV—i—RNA)诱生血清特异性抗体活性和以细胞毒活性为指标检测其增强细胞免疫的作用。实验结果表明:RSV-i-RNA能诱生血清特异性抗体和提高鼠脾细胞对靶细胞的杀伤作用,且明显高于正常核糖核酸对照组。 RSV-i-RNA的上述作用可被RNase所阻断,但不受DNase和Pronase的影响。     

Evaluation of the Safety and Immune Efficacy of Recombinant Human Respiratory Syncytial Virus Strain Long Live Attenuated Vaccine Candidates

Human respiratory syncytial virus(RSV) infection is the leading cause of lower respiratory tract illness(LRTI), and no vaccine against LRTI has proven to be safe and effective in infants. Our study assessed attenuated recombinant RSVs as vaccine candidates to prevent RSV infection in mice. The constructed recombinant plasmids harbored(5' to 3') a T7 promoter, hammerhead ribozyme, RSV Long strain antigenomic cDNA with cold-passaged(cp) mutations or cp combined with temperature-sensitive attenuated mutations from the A2 strain(A2cpts) or further combined with SH gene deletion(A2cpts△SH), HDV ribozyme(δ), and a T7 terminator. These vectors were subsequently co-transfected with four helper plasmids encoding N, P, L, and M2-1 viral proteins into BHK/T7-9 cells, and the recovered viruses were then passaged in Vero cells. The rescued recombinant RSVs(rRSVs) were named rRSV-Long/A2 cp, rRSV-Long/A2 cpts, and rRSV-Long/A2 cpts △SH, respectively, and stably passaged in vitro, without reversion to wild type(wt) at sites containing introduced mutations or deletion. Although rRSV-Long/A2 cpts and rRSV-Long/A2 cpts △SH displayed temperature-sensitive(ts)phenotype in vitro and in vivo, all rRSVs were significantly attenuated in vivo. Furthermore, BALB/c mice immunized with rRSVs produced Th1-biased immune response, resisted wt RSV infection, and were free from enhanced respiratory disease.We showed that the combination of △SH with attenuation(att) mutations of cpts contributed to improving att phenotype,efficacy, and gene stability of rRSV. By successfully introducing att mutations and SH gene deletion into the RSV Long parent and producing three rRSV strains, we have laid an important foundation for the development of RSV live attenuated vaccines.     

呼吸道合胞病毒Long株的培养及应用

建立可稳定收获高滴度RSVLong株病毒的培养方法 ,所获得的RSVLong株病毒液用于RSV抗体ELISA检测。RSVLong株病毒 33℃传至 4代后 ,病毒滴度升高 ,出现典型的细胞病变。以RSVLong株病毒液作抗原所建立的ELISA试剂盒能检测出RSV特异性抗体。     

Bioconjugated nanoparticle detection of respiratory syncytial virus infection

The integration of nanotechnology with biology has produced major advances in molecular diagnostics, therapeutics, and bioengineering. Recent advances have led to the development of functionalized nanoparticles (NPs) that are covalently linked to biological molecules such as antibodies, peptides, proteins, and nucleic acids. These functionalized NPs allow for development of novel diagnostic tools and methods, particularly for pathogens, as rapid and sensitive diagnostics are essential for defining the emergence of infection, determining the period that preventive measures should be applied, for evaluating drug and vaccine efficacy, and for controlling epidemics. In this study, we show that functionalized NPs conjugated to monoclonal antibodies can be used to rapidly and specifically detect respiratory syncytial virus in vitro and in vivo. These results suggest that functionalized NPs can provide direct, rapid, and sensitive detection of viruses and thereby bridge the gap between current cumbersome virus detection assays and the burgeoning need for more rapid and sensitive detection of viral agents.     

艾叶挥发油抗病毒作用的初步研究

通过微量细胞病变抑制法,初步研究艾叶挥发油对呼吸道合胞病毒(RSV),流感病毒(IFV)的体外抑制作用。从艾叶挥发油的最大无毒量(TD0 )开始,作连续倍比稀释6个浓度,每一浓度均做4孔,分别加入已感染RSV的单层Hela细胞和感染IFV的单层MDCK细胞中,并设立阴性和阳性对照, 37℃,体积分数为5% CO2 培养,连续动态观察,得到药物的半数有效量(IC50 ),并计算治疗指数(TI)。艾叶挥发油对RSV的IC50为3. 33mg·L-1,TI值为9. 4。对IFV没有抑制作用。结论:艾叶挥发油对RSV有一定的抑制作用,对IFV的抑制作用不明显。