中外两品种鸡胸肌组织差异表达基因的研究

运用mRNA差异显示技术对北京油鸡和AA肉鸡胸肌组织基因的差异表达进行研究, 从分子水平分析导致两品种肌肉组织基因差异表达的机制。通过反向Northern dot blot技术验证共筛选出差异表达基因7条, 经与GenBank数据库进行相似性比对, S1与HMGN3基因有较高同源性; S3与ChEST294a8有很高同源性, 但功能未知; S4和S5与鸡的磷酸葡萄糖变位酶Ⅰ同源性很高; S6和S2与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高同源性, 为已知的EST, 但功能未知; 序列S7未在数据中发现同源序列, 可以确定其在AA肉鸡中特异表达,确定为新发现的EST(GenBank登录号: EU594549)。为进一步研究中外两品种鸡胸肌组织基因差异表达机制奠定了基础。     

外加紫杉醇对悬浮培养东北红豆杉细胞的诱导效应

研究表明外加紫杉醇能够诱导悬浮培养的东北红豆杉(Taxus cuspidata)细胞总DNA发生梯带化降解。利用mRNA差异显示技术比较了紫杉醇诱导凋亡与不诱导凋亡的东北红豆杉细胞基因表达的差异,得到了8个特异表达的cDNA克隆,经Northern杂交证实其中3个在不发生凋亡的细胞中表达,5个在凋亡的细胞中表达。对这8个cDNA克隆单向序列测定后,与GenBank/EMBL/DDBJ中同源序列进行了比较,结果表明：1个cDNA片段与拟南芥中ABA应答蛋白基因的保守区有86%的同源性;2个cDNA片段与番茄内切壳聚糖酶前体基因的保守区有50%的同源性;其他5个cDNA片段无明显的同源基因,可能是新基因。     

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38抗病相关基因片段的分离

利用差异显示技术,分析小麦TcLr38受小麦叶锈菌诱导的mRNA表达丰度差异,获得了136条差异条带。对136条差异条带进行了回收、重扩增和反向Northern杂交检测,获得一条杂交信号阳性的片段,对该片段进行克隆、测序,该片段长度为425bp。在GenBank中进行Blast比对分析,与普通小麦(Triticum aestivum)同源性较高,并且与小麦抗盐cDNA序列也有较高的同源性;在GrainGenes中进行Blast比对,与小麦的远源亲本粗山羊草(Aegilops tauschii)、栽培一粒小麦(T.monococ-cum)和普通小麦具有较高同源性。利用SegMan软件进行电子克隆延长该片段,未找到与其相符的重叠群。因此确定该片段为TcLr38的cDNA片段,并初步推测该片段可能为一小麦抗病相关基因片段。     

一个血清抑制基因的克隆

比较血清培养细胞和血清饥饿细胞的基因表达差异,获得了一段血清饥饿细胞中特异表达的cDNA序列,以此序列出发,通过搜索表达序列标签(EST),拼接出完整的基因序列,通过PCR分段克隆获得全长cDNA序列.该基因全长5 429 bp,编码框预测有791个氨基酸残基.GenBank搜索,该基因与已有的细胞周期调控基因没有同源性.所以,该基因是一个新的与细胞周期有关的基因（GenBank接受号：AY050169）.由于该基因最初发现在无血清培养条件下表达,故叫血清抑制基因（serum inhibit gene,Si-1基因）.     

性逆转石斑鱼脑垂体差异表达基因克隆的筛选

以17α甲基睾丸酮投喂赤点石斑鱼(Epinephelusakaara),成功地获得了性逆转的有功能的雄鱼。用SMARTcDNA合成和长片段PCR技术构建了性逆转前后脑垂体cDNA文库;用抑制消减杂交技术建立了性反转前后抑制性差减文库。对获得的560个雄鱼脑垂体PCR阳性克隆和350个雌鱼脑垂体PCR阳性克隆进行斑点杂交,共筛选到103个差异表达cDNA片段。对其中29个克隆进行了测序,与GenBank中的已知基因序列进行同源性比较,发现有6个片段为促性腺激素α亚基前体基因(GenBank注册号:AY207430),与同属不同种的石斑鱼促性腺激素α亚基前体基因有97%的同源性;1个片段为生长激素前体(GenBank注册号:AY207431),与同属不同种的石斑鱼生长激素前体基因有99%的同源性;其余22个cDNA片段与GenBank中的序列无明显同源性 。     

高粱幼苗水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究

以高粱为试验材料,用-0．7MPa的PEG-6000高渗溶液对其幼苗进行水分胁迫处理,利用mRNA差异显示技术分离得到53条高粱水分胁迫诱导表达的cDNA片段,其中包括5个完全诱导表达片段,43个上调片段和5个下调表达片段。经过Reverse Northern验证,筛选出13个差异表达的cDNA片段,并进行克隆测序。经GenBank查询,10个片段序列与已知序列有较高的同源性,3个片段同源性非常低,可能为新基因。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

滨梅2个肌动蛋白cDNA片段的克隆与表达

目的:克隆耐盐碱果树滨梅的肌动蛋白基因actin,为该物种优异性状基因的功能鉴定提供内参.方法:利用一对actin简并引物克隆滨梅actin cDNA片段,对其进行序列和表达分析.结果:得到2条743 bp的cDNA片段,两条核苷酸序列相似性为82％,命名为PmAct1和PmAct2并在GenBank登录(分别为JX855160和JX855161);序列比对发现2条actin片段氨基酸序列与其他植物同源性均在96％以上;根据不同果树Actin相似性构建进化树,表明2个滨梅actin明显分为两种类型,但均与蔷薇科果树亲缘关系较密切;半定量RT-PCR表达谱发现PmAct1可能为组成型表达类型,而PmAct2特异地在根和叶组织中表达量较高.结论:首次获得了2个滨梅actin基因,为该物种其他功能基因的挖掘和表达分析奠定了基础.     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

小麦拔节过程中基部茎节的基因差异表达

采用差异显示逆转录PCR(DD-RT-PCR)技术分析小麦基部茎节伸长过程中基因表达差异的结果表明,小麦拔节前和拔节后基部茎节中存在明显的基因表达差异(包括质和量的差异).从具有质的差异表达基因中挑选了4个基因进行cDNA片段(编号为WSRI～4)的克隆,测序和GenBank数据库序列同源性比对分析,结果显示,WSRI与大麦中编码Ser/Thr蛋白激酶的序列具有很高的同源性,WSR2的功能未知,WSR3高度同源于玉米中码Ty3/gypsy类Kg-座子反转录酶的序列,WSR4高度同源于小麦的端粒关联DNA.半定量RT-PCR技术分析拔节过程中克隆基因WSRl～4表达特性显示,除了WSR4以外,其余3个基因的表达模式和通过DD-RT-PCR分析所展示的差异表达趋势基本一致.     

猪早期孤雌激活胚不同发育阶段差异基因表达的研究

收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的猪孤雌激活胚,采用SPEDDRT-PCR方法挑选不同时期的差异表达产物,通过反向northern杂交去除假阳性的条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序,筛选了8个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DD1-DD8。经过与GenBank中的数据进行同源性分析,发现其中DD1和DD2没有相似的数据, 提交数据库获得GenBank登录号(EU545158, EU545159);其余的DD3-DD8发现了相似性较高的数据,但除DD3外均无基因功能说明需要进行进一步的研究。     

A large scale analysis of cDNA in Arabidopsis thaliana: generation of 12,028 non-redundant expressed sequence tags from normalized and size-selected cDNA libraries.

For comprehensive analysis of genes expressed in the model dicotyledonous plant, Arabidopsis thaliana, expressed sequence tags (ESTs) were accumulated. Normalized and size-selected cDNA libraries were constructed from aboveground organs, flower buds, roots, green siliques and liquid-cultured seedlings, respectively, and a total of 14,026 5'-end ESTs and 39,207 3'-end ESTs were obtained. The 3'-end ESTs could be clustered into 12,028 non-redundant groups. Similarity search of the non-redundant ESTs against the public non-redundant protein database indicated that 4816 groups show similarity to genes of known function, 1864 to hypothetical genes, and the remaining 5348 are novel sequences. Gene coverage by the non-redundant ESTs was analyzed using the annotated genomic sequences of approximately 10 Mb on chromosomes 3 and 5. A total of 923 regions were hit by at least one EST, among which only 499 regions were hit by the ESTs deposited in the public database. The result indicates that the EST source generated in this project complements the EST data in the public database and facilitates new gene discovery.     

转化的大鼠胚胎成纤维细胞系差异表达基因的筛选研究

来源于转化的大鼠胚胎成纤维细胞系的两株细胞,A1－5细胞与B4细胞相比表现出非常强的抗辐射性并伴随不同寻常强的G2延迟效应;用PCR选择性抑制消减杂交方法对这两株细胞进行差减,希望找到对A1－5细胞表现出的不同寻常的表型起关键作用的某一个或某一些基因。结果得到了160个差减转化子,逐个进行序列测定,并进行Dot blot杂交,共得到35个差异表达基因片段（EST）。通过对美国国家生物技术信息中心（NCBI）的非冗余序列库（NT）、鼠EST库及人EST库的BLAST进行同源检索,发现其中21个代表了尚未登录的新基因,另外14个分别与已知基因高度同源。     

抗口蹄疫病毒相关基因的筛选及分析

口蹄疫是一种烈性传染病,其广泛流行给社会造成了巨大经济损失。为了研究口蹄疫灭活疫苗免疫的分子机制,同时也为抗口蹄疫病毒药物的研制奠定基础,本研究应用mRNA差异显示技术,以PK-15细胞为材料,系统比较了口蹄疫疫苗刺激组（A组）和正常的PK-15细胞（B组）的基因表达情况,回收差异片段,经二次扩增并纯化后,得到30条ESTs。将30条ESTs采用以地高辛标记的反向Northern点杂交鉴定,将阳性条带克隆测序,筛选出8条ESTs,编号E1~E8,应用BLASTn工具将8条ESTs对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析,其中E1,E2分别与猪的热休克蛋白基因、猪的MHCⅠ类基因同源,序列相似性都达到100%。E3,E4,E5,E7分别与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高同源性,为已知的EST,但功能未知;E6,E8在数据库中没有发现与其相似性较高的序列,为新的EST。应用数据库资源将E5、E7进行电子延伸后,将延伸序列进行开放阅读框分析,又经TBLASTx分析发现E7蛋白质序列与猪的精氨酸酶Ⅰ类蛋白序列有很高同源性。将E1、E2、E4、E5序列进行了基因表达谱分析,对E6、E8用BLASTx工具对非冗余蛋白质数据库nr进行了相似性搜索,在其他物种中找到了相似的基因序列。本研究筛选出的热休克蛋白基因、MHCⅠ类基因、精氨酸酶Ⅰ类基因和其他未知功能基因可以作为抗口蹄疫病毒研究中的侯选基因,其具体的功能有待今后进一步研究。     

Human trash ESTs--sequences from cDNA collection that are not aligned to genome assembly

Expressed sequence tags (ESTs) represent 500-1000-bp-long sequences corresponding to mRNAs derived from different sources (cell lines, tissues, etc.). The human EST database contains over 8,000,000 sequences, with over 4,000,000,000 total nucleotides. RNA molecules are transcribed from a genomic DNA template; therefore, all ESTs should match corresponding genomes. Nevertheless, we have found in the human EST database approximately 11,000 ESTs not matching sequences in the human genome database. The presence of "trash" ESTs (TESTs) in the EST database could result from DNA or RNA contamination of the laboratory equipment, tissues, or cell lines. TESTs could also represent sequences from unidentified human genes or from species inhabiting the human body. Here, we attempt to identify the sources of human EST database contaminations. In particular, we discuss systematic contamination of the mammalian EST databases with sequences of plants.