乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）北大核心CSCD

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。     

挖掘与调控乙酸胁迫响应基因提高重组酿酒酵母合成番茄红素水平

【背景】乙酰辅酶A是酿酒酵母异源合成番茄红素的重要中间产物,胞质中乙酰辅酶A主要来自乙酰辅酶A合成酶催化乙酸合成。【目的】通过外源添加乙酸盐结合调控乙酸胁迫应答基因增加胞内乙酰辅酶A含量,改善细胞生长,促进番茄红素合成。【方法】在合成番茄红素的重组酵母菌中过表达乙酰辅酶A合成酶编码基因(acs2),在发酵过程中添加10g/L乙酸盐,结合转录组学分析挖掘乙酸胁迫响应基因,进行单一和组合调控。【结果】添加乙酸盐后,重组菌Y02中番茄红素含量增加了19.14%,但细胞生长受到抑制,转录组学结果表明adk2、fap7、hem13、elo3、pdc5、set5、pmt5、hst4、clb2和swe1表达水平增加,因此构建了单基因和双基因过表达菌株,其中Y02-set5-hst4菌在添加乙酸盐后细胞生长得到了显著改善,同时胞内乙酰辅酶A浓度提高了78.21%,番茄红素含量和产量达到12.62 mg/g-DCW和108.67 mg/L,与对照菌Y02相比分别提高了42.76%和67.13%。同时该菌中甲羟戊酸途径中关键基因erg12、erg20和hmg1的表达量与对照菌相比分别上调了1.70、1.4...     

强化乙酰辅酶A供应对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸的影响

细胞液中乙酰辅酶A的持续供应是脂肪酸高效积累的必要条件。考虑到甲羟戊酸和脂肪酸合成途径共用相同的前体乙酰辅酶A,抑制甲羟戊酸途径可能促使更多的乙酰辅酶A流向脂肪酸合成。通过添加前体物质或/和甲羟戊酸途径酶的抑制剂以强化乙酰辅酶A的供应,即在裂殖壶菌发酵起始或/和后期添加乙酸、发酵起始添加甲羟戊酸途径酶的抑制剂辛伐他汀或柠檬酸、发酵起始同时添加乙酸和辛伐他汀或柠檬酸并考察其对裂殖壶菌合成二十二碳六烯酸 (DHA)的影响,结果发现发酵起始同时添加6mmol/L的乙酸和1μmol/L的辛伐他汀时,DHA产量最高,达到13.21g/L,比对照提高了46.61%。     

体外苏氨酸循环固碳途径的构建

乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。由于在体外验证文献报道的高碳摩尔得率合成乙酰CoA的苏氨酸循环固碳途径,有较重要的理论意义和应用价值。因此在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(Tdc B)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5 mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2 mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。     

一种基于途径分析提高丙酮酸产量的育种策略

为进一步提高光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的水平 ,在途径分析的基础上提出了一种组成型降低丙酮酸脱酸酶、但增强乙酰辅酶A合成酶活性的育种策略。通过亚硝基胍诱变 ,获得 1株乙酸需求型突变株CCTCCM2 0 2 0 19,在外加乙酸的培养基中表现出高于出发株 2 1%的丙酮酸生产能力和良好的遗传稳定性。检测突变株CCTCCM2 0 2 0 19中丙酮酸代谢相关酶的活性发现 :(1)丙酮酸脱羧酶活性降低了 4 0 % ;(2 )外加乙酸与否的条件下 ,乙酰辅酶A合成酶的活性分别提高了 10 3 5 %和 5 7 4 % ;(3)添加乙酸和突变对丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶系、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性没有显著影响。在含有乙酸的培养基中突变株细胞干重比出发株高 2 1 7% ,可能是因为乙酰辅酶A合成酶活性的提高 ,补充了因丙酮酸脱羧酶活性降低而引起的胞质乙酰辅酶A短缺。在 7L罐中含有 6g L乙酸钠的培养基中发酵 6 2h ,丙酮酸产量达到 6 8 7g L ,对葡萄糖的产率为 0 6 5 1g g。     

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进a-酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T. glabrata ACS2-1：(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303 的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、a-酮戊二酸产量和Ca-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,a-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累a-酮戊二酸。     

硝酸盐对牛粪梭菌甲酸脱氢酶缺失型Wood-Ljungdahl途径固碳的影响

【背景】异于同型产乙酸菌通常利用Wood-Ljungdahl途径将2分子CO₂还原为1分子乙酰辅酶A,Clostridium bovifaecis缺失Wood-Ljungdahl途径甲基支路第1步将CO₂还原为甲酸的甲酸脱氢酶,需甲酸存在时将1分子甲酸和1分子CO₂还原为乙酰辅酶A发生葡萄糖的同型产乙酸型发酵。已有报道显示,硝酸盐也可作为同型产乙酸菌的电子受体,而且对不同同型产乙酸菌的代谢影响有所不同,然而硝酸盐对这种独特的甲酸脱氢酶缺失型Wood-Ljungdahl途径固碳的影响尚不清楚。【目的】探究硝酸盐对C.bovifaecis甲酸脱氢酶缺失型Wood-Ljungdahl途径固碳的影响。【方法】硝酸盐浓度分别为10 mmol/L和30 mmol/L时,以未添加硝酸盐为对照实验,研究C.bovifaecis在葡萄糖+甲酸+CO₂为基质条件下的细菌生长、底物消耗和产物生成情况。【结果】10 mmol/L和30 mmol/L硝酸盐存在时,主要产物乙醇浓度分别为5.80 mmol/L和1.66 mmo...     

3个植物源苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯的研究

[背景]乙酸肉桂酯是一种重要的香料化合物,在化妆品和食品工业上具有广泛的应用,传统的生产方法主要依靠植物提取和化学合成。[目的]通过筛选不同植物源的酰基转移酶,利用大肠杆菌从头合成乙酸肉桂酯。[方法]首先,通过在苯丙氨酸高产菌BPHE中表达异源基因苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase from Arabidopsis thaliana,AtPAL)、对羟基肉桂酰辅酶A连接酶(Hydroxycinnamate:CoA Ligase from Petroselinum crispum,Pc4CL)和肉桂酰辅酶 A 还原酶(Cinnamyl-CoA Reductase from Arabidopsis thaliana,AtCCR),并结合大肠杆菌自身的内源性醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenases,ADHs)或醛酮还原酶(Aldo-Keto Reductases,AKRs)的催化作用构建了从苯丙氨酸到肉桂醇的生物合成途径。然后,苯甲醇苯甲酰转移酶(Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Nicotiana tabacum,ANN09798;Benzyl Alcohol O-Benzoyltransferase from Clarkia breweri,ANN09796)或苯甲醇乙酰转移酶(Benzyl Alcohol Acetyltransferase from Clarkia breweri,BEAT)被引入到上述重组大肠杆菌中发酵培养生产乙酸肉桂酯。最后,在大肠杆菌中过表达乙酰辅酶A合成酶(Acetyl Coenzyme A Synthetase,ACS)来提高底物乙酰辅酶A的量。[结果]探讨了 3个植物源苯甲醇酰基转移酶生物合成乙酸肉桂酯的能力,并应用于合成乙酸肉桂酯的细胞工厂,最终使乙酸肉桂酯最高产量达到166.9±6.6mg/L。[结论]植物源苯甲醇酰基转移酶具有一定的底物宽泛性,能以肉桂醇为底物催化合成乙酸肉桂酯。首次利用植物源的苯甲醇酰基转移酶合成乙酸肉桂酯,为微生物细胞工厂以葡萄糖作为碳源生产乙酸肉桂酯提供参考。     

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进α－酮戊二酸合成

[目的]为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响.[方法]将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20 U/mg protein)的重组菌T. glabrataACS2-1.[结果]与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T glabrataACS2-1:(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94 mmol/(L·g DCW)的L酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG,Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4 g/L 乙酸,使乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和CαKG>>/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-酮戊二酸浓度达到17.8 g/L.[结论]这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸.     

聚球藻7942混养培养中碳代谢与能量利用

为了考察聚球藻7942在混养条件下的能量利用效率,分别以葡萄糖和乙酸为碳源开展了聚球藻7942的混养培养研究,并在此基础上利用代谢通量分析方法对聚球藻7942混养条件下的碳代谢和能量利用进行了探讨。结果表明:葡萄糖和乙酸均能促进藻细胞生长,且乙酸促进藻细胞生长的作用更为明显;葡萄糖利用可明显增加藻细胞糖酵解途径中碳代谢流量,而乙酸利用则导致糖酵解途径中碳代谢流量减小,两种有机碳源均增加了柠檬酸循环中碳代谢流量;有机碳源导致藻细胞光化学效率下降,而葡萄糖较之乙酸降低藻细胞光化学效率更为明显。虽然混养条件下光能的贡献率要小于光自养,但基于能量的细胞得率和能量转换率均高于光自养,光自养和以葡萄糖、乙酸为碳源的混养中基于ATP生成的能量转换效率分别为6.81%、7.43%和8.77%。     

乙酰辅酶A合成代谢对酿酒酵母生理功能的影响

【目的】研究酿酒酵母(Saccharomycesc erevisiae)中乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和ACS2的生理作用。【方法】将来源于S.cerevisiae的ACS1和ACS2分别进行过量表达,研究过量表达ACS1和ACS2后S.cerevisiae胞内乙酰辅酶A含量、ATP水平、甲羟戊酸途径转录和乙醇耐受性等生理学特性变化。【结果】与出发菌株相比,过量表达ACS1和ACS2使得:(1)胞内乙酰辅酶A含量提高了2.19倍(ACS1)和5.02倍(ACS2);(2)胞内ATP含量提高了3.93倍(ACS1)和2.05倍(ACS2);(3)甲羟戊酸途径8个关键基因表达量显著上调;(4)S.cerevisiae对乙醇胁迫抵御能力显著增强。过量表达ACS1对乙醇胁迫的耐受能力强于过量表达ACS2。【结论】增加胞内乙酰辅酶A的含量可以显著增加甲羟戊酸途径碳代谢流量,并增强S.cerevisiae对发酵过程主要副产物乙醇的耐受能力。     

鱼腥藻PCC 7120乙酰辅酶A合成酶All0769的缺失降低异形胞频率

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶A合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC7120中的乙酰辅酶A合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶A合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的生成。在供氮环境下,敲除all0769会影响藻细胞生长速率。而无论环境中是否存在化合氮,Δall0769突变株的乙酰辅酶A和α-酮戊二酸含量均显著减少。在供氮环境下,Δall0769突变株中检测到(26.17±1.55) nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(43.04±1.09) nmol/mg的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸[(1.41±0.24) nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.13±0.05) nmol/mg protein]。在缺氮环境下,Δall0769突变株中检测到(10.00±2.81) nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(29.82±4.04) nmol/mg protein的乙酰辅酶A。Δall07...     

臭味假单胞菌乙酰乙酰辅酶A硫解酶的提纯及性质研究

从臭味假单胞菌中提纯97倍的AcAcCoA硫解酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳上是均一的一带。该酶分子量为170,000,每分子含有4个亚基,亚基分子量为42,000。该酶的等电点为pI6.7。它的N-末端为丙氨酸,N-末端是单一的。该酶催化反应的Km值为10.2μmol/L,最大反应速度为16.7μmol/min·mg。 臭味假单胞菌细胞粗提液透析后,经DEAE-纤维素(DE-52)柱色谱,从洗脱液中可同时得到四个酶的活力峰:乙酰乙酸琥珀酰辅酶A转移酶,AcAcCoA硫解酶,β-酮已二酸琥珀酰辅酶A转移酶和β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶。一般认为在细菌的芳径代谢中存在β-酮己二酸代谢途径,上述四个酶的活力峰同时存在说明除β-酮已二酸代谢途径外,还同时存在乙酰乙酸代谢途径。     

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现：通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。     

微生物合成丙二酰辅酶A衍生物的代谢工程

丙二酰辅酶A是一种重要的微生物胞内代谢中间产物,由于其独特的结构,可衍生为几类具有独特结构的化合物,包括:脂肪酸类化合物、生物基化学品和植物源黄酮及聚酮类天然产物等。这些化合物广泛应用于食品、医药、化工和能源等领域。目前,微生物大量合成上述丙二酰辅酶A衍生物的限制性因素是其胞内较低的丙二酰辅酶A含量。本文中,笔者以提高微生物合成丙二酰辅酶A衍生物为核心,综述了提高其前体丙二酰辅酶A导向目标产物的代谢工程策略,包括丙二酰辅酶A合成途径的强化、竞争支路途径的消减以及其含量的精细调控等,以期为微生物合成丙二酰辅酶A衍生物的进一步研究提供参考。     

酪丁酸梭菌代谢工程菌的构建及其发酵特性

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵,主要发酵产物为丁酸和乙酸,是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。将酪丁酸梭菌乙酸发酵关键基因取代为丁酸发酵关键基因来构建突变株,可使突变株丁酸发酵量增多,乙酸发酵量减少。分别获得来源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代谢关键酶基因——乙酰乙酰辅酶A转移酶基因(thl)、来源于酪丁酸梭菌本身的乙酸代谢关键酶基因片段——磷酸转乙酰基酶基因片段(pta)和来源于质粒pIMP1的红霉素抗性基因(em)。将它们与质粒pUC19相连构建为非复制性质粒pUC19-EPT。通过电转化将其导入酪丁酸梭菌中。利用红霉素抗性平板筛选获得转化子,通过PCR验证发现,获得的突变株染色体上pta被thl替换。在以葡萄糖为底物的发酵中,突变株丁酸得率为0.47,较野生型增大了34%,乙酸得率为0.05,较野生型下降了29%。     

阻断嗜乙酰乙酸棒杆菌乙酸合成途径对其在缺氧条件下产琥珀酸的影响

为探究和阻断嗜乙酰乙酸棒杆菌乙酸代谢途径,提高缺氧条件下琥珀酸的产率,减少副产物乙酸的合成,以C. acetoacidophilum ΔldhA为出发菌株,利用同源重组的方法分别敲除磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、CoA转移酶和丙酮酸脱氢酶复合体的相关基因pta,ackA,ctfA与aceE,研究突变菌产琥珀酸过程中相关参数的变化。结果表明：敲除pta与ackA基因后,对乙酸浓度,糖耗速率和糖酸转化率影响不大;pta,ackA与ctfA基因的同时失活使得乙酸的浓度和摩尔转化率分别降低81.4%和77.2%,葡萄糖消耗速率下降28.3%,琥珀酸对葡萄糖摩尔转化率提高25.3%;而单独敲除aceE基因后,乙酸几乎不产生,葡萄糖消耗速率下降35.6%,琥珀酸对葡萄糖摩尔转化率提高34.7%。因此,缺氧条件下,嗜乙酰乙酸棒杆菌的乙酸合成几乎全部走乙酰CoA途径,pta,ackA与ctfA是由乙酰CoA合成乙酸途径中最主要的基因;敲除基因aceE, 可以完全阻断乙酸生成,有效提高琥珀酸产率。     

代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

【背景】Escherichia coli AFP111发酵生产丁二酸时大量副产乙酸,丁二酸得率低。【目的】代谢工程改造EscherichiacoliAFP111,提高丁二酸得率,降低副产物乙酸的生成,建立100 L规模的丁二酸发酵工艺。【方法】一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因,改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达;单因素优化5L发酵罐培养条件。【结果】敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta、苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02菌株,摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42%,丁二酸得率提高9.85%。在SX02菌株基础上,经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk后获得菌株SX03,其Glk酶活性提高3.66倍,乙酸产量下降了31.62%,丁二酸得率提高8.28%。SX03菌株发酵生产丁二酸在5 L发酵罐进行放大,其乙酸产量为3.97 g/L,丁二酸得率为1.62 mol/mol葡萄糖,相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76%,丁二酸得率提高19.12%。在5L发酵罐上对比研究了中和剂Na2CO3和NaOH混合液替换碱式MgCO3的发酵效果,并优化了发酵pH、搅拌转速和葡萄糖浓度,获得如下最适发酵条件:pH6.8,搅拌转速250r/min,葡萄糖100g/L,发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L,丁二酸得率为1.66 mol/mol葡萄糖。中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65%,丁二酸得率提高2.47%。菌株SX03发酵工艺进一步在100 L发酵罐上实现放大,其乙酸产量为1.91 g/L,丁二酸得率为1.30 mol/mol葡萄糖。【结论】通过代谢工程改造的大肠杆菌,其副产物乙酸含量显著下降,丁二酸得率提高,并在5 L和100 L发酵罐上实现了工艺放大,展现出较大的工业化利用潜力。     

天然产物中五元杂环生物合成过程的研究进展

五元杂环是指一类含有除碳以外的杂原子的五元环有机化合物,可分为含有一个杂原子的杂环和含有两个杂原子的五元杂环。杂原子通常为氮原子、氧原子或硫原子,在成环时符合休克尔(Hückel)规则,具有芳香性。五元杂环以独特的生物学特性和参与氢键相互作用的能力,成为天然化合物发挥活性功能的重要基团。五元杂环在不同的生物合成途径中有多种环化过程,其前体可以是天然氨基酸、乙酸及乙酰辅酶A等多种形式。将从吡咯、恶唑和噻唑三种五元杂环入手,以代表性化合物为例,对其在生命体中生物合成过程的成环过程进行探讨,为组合生物合成和未知化合物中五元杂环成环过程的研究提供参考。