拟柱孢藻N8全基因组测序及磷吸收转运通路的比较分析

为从分子水平解析热带特征性蓝藻-拉氏拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii, 简称拟柱孢藻)环境适应机制, 研究以广东省镇海水库中分离的拟柱孢藻藻株N8为材料, 采用PacBio单分子实时测序技术(Single Molecule Real-Time, SMRT)进行测序, 并初步进行全基因组特征的比较分析。结果显示拟柱孢藻N8全基因组大小为3.857 Mb, GC含量为40.13 %, 预测编码基因个数为3598个, 在COG、KEGG和GO数据库中注释到的基因数分别为2429、1664和2244个。N8藻株与美国国立生物技术信息中心(NCBI)上公布的27株拟柱孢藻基因组大小和GC含量基本一致, 但N8的编码基因数最多。基于拟柱孢藻全基因组单拷贝基因的系统进化树表明N8藻株与韩国藻株GIHE 2018的亲缘关系最近。N8藻株的基因组中未发现拟柱孢藻毒素(CYN)和石房蛤毒素(STX)合成酶基因簇, 表明该藻株不产蓝藻毒素CYN和STX。对N8藻株和其他7藻株的磷吸收转运通路比较分析表明, 这些藻株均拥有较为完整的磷吸收转运基因(双组分调节系统、低亲和力无机磷转运基因、高亲和力无机磷转运系统、有机磷酸盐转运复合体、C-P裂解酶和碱性磷酸酶), 表明拟柱孢藻具有灵活利用环境中不同形态磷源的潜能; 而不同藻株间的基因拷贝数和排列顺序存在差异, 如拟柱孢藻N8基因组中有2个C-P裂解酶复合体蛋白phnF和phnM, 其余7株拟柱孢藻则只有1个, 表明拟柱孢藻存在株系特异性。N8藻株为中国首株公开完成全基因组测序数据的拟柱孢藻, 对其基因组分析和磷吸收转运通路的解析将有助于阐明华南地区拟柱孢藻水华优势形成的分子机制。     

镇海水库拟柱孢藻的分离鉴定和氮磷对其生长的影响

以分离自广东省镇海水库的拟柱孢藻N8为对象, 探究其在不同磷浓度及氮磷浓度组合下的生长情况。结果表明, 拟柱孢藻N8对磷的适应范围很宽, 在0.025.12 mg/L磷浓度下均能生长, 最适生长磷浓度范围为0.165.12 mg/L, 磷浓度的升高能显著延长拟柱孢藻的对数生长期和提高生物量。动力学分析表明, 拟柱孢藻N8有较低的KSP值, 对磷元素的亲和性较高, 在磷营养贫乏的环境下更容易形成优势。在氮磷组合实验中, 低氮(0.5 mg/L)显著抑制拟柱孢藻的生长, 且这种生长抑制不受磷浓度的影响; 而在低磷(0.04 mg/L)条件下, 水体中氮浓度的增加会显著促进拟柱孢藻的生长, 拟柱孢藻在高氮中磷和高氮高磷下的生长显著优于其他氮磷组合条件。研究表明, 广东省水库拟柱孢藻的生长受磷的限制较弱, 氮是其生长的决定因子。       

光照-温度交互作用及不同氮源对拟柱孢藻生长的影响

为探讨不同环境因子对拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii)生长的影响,对从广东省镇海水库分离的2株拟柱孢藻在不同的温度和光照组合,及不同氮源条件下的生长进行了研究。结果表明,在3种光强下,拟柱孢藻N1和N8藻株的生长随温度的上升而增加,均在28℃高光强下达到最大比生长速率,而N8藻株对低温的适应能力要高于N1藻株。拟柱孢藻N1和N8在各硝态氮浓度下均能正常生长,但仅能在中低浓度的铵态氮和尿素氮中生长,高浓度(128~247 mg L–1)的铵态氮和尿素氮会显著抑制藻细胞生长;在3种氮源下,N1藻株的比生长速率均显著大于N8藻株,这说明N1藻株对不同氮源的利用能力要高于N8藻株。因此,广东省的拟柱孢藻具株系多样性,喜好高温,适应较宽的光照范围,并可利用多种氮源用于生长,这可能是该地区拟柱孢藻水华频发的原因。     

大沙河水库拟柱孢藻昼夜垂直分布特征

为了解大沙河水库拟柱孢藻(Raphidiopsis raciborskii)昼夜垂直分布模式,于2018年9月20—21日(丰水期)和2018年12月31日(枯水期)对该水库拟柱孢藻进行昼夜定点分层采样,分析影响拟柱孢藻垂直分布的主要环境因子。用Morisita指数和平均滞留深度定量检验拟柱孢藻垂直分布格局;用方差分析检验拟柱孢藻是否存在昼夜垂直迁移现象,并采用多元回归方法分析拟柱孢藻垂直分布格局和环境因子的关系。结果表明:拟柱孢藻在丰水期呈现集群分布模式,主要分布于0.5～2 m水层,平均滞留深度为1.5 m;枯水期在6 m水深以上的水层呈现随机分布模式;丰水期和枯水期均无明显的昼夜垂直迁移现象;大沙河水库温跃层的出现是影响拟柱孢藻的昼夜垂直分布模式的主导因素。     

一株虾池来源的螺旋拟柱孢藻藻株的分离鉴定及重金属离子Cu~(2+)、Cd~(2+)和Pb~(2+)对其生长的影响

【目的】探讨凡纳滨对虾养殖水体中入侵蓝藻拟柱孢藻的生长生理特性。【方法】从汕头澄海人工对虾养殖池分离纯化藻株,通过形态及其16SrRNA基因鉴定,之后在CT与BG11两种蓝藻通用培养基的基础上优化最佳培养条件,最后分析了不同浓度的3种重金属离子即Cu~(2+)(0–0.8 mg/L)、Cd~(2+)(0–4 mg/L)和Pb~(2+)(0–80 mg/L)对藻株生长的影响。【结果】澄海虾池来源的分离纯化藻株形态呈卷曲螺旋型,16S rRNA基因序列与多株其他来源的拟柱孢藻相似度均达98%以上。实验室培养,藻株最佳生长状态的培养条件是在BG11培养基的基础上调整氮浓度及氮磷比分别为N 62 mg/L,N︰P=9︰1,在此条件下,藻丝生物量可达(0.632±0.170)×107/L,藻丝比平均生长速率最高为(0.063±0.001)/d。本分离藻株活体对重金属Cu~(2+)、Cd~(2+)和Pb~(2+)具有一定的耐受性,其耐受浓度范围分别为0–0.2、0–0.5和1–40 mg/L,其中,Cu~(2+)和Cd~(2+)对藻的生长具有抑制作用,而且此抑制作用随着金属离子剂量的增加及作用时间的延长更加显著,Cu~(2+)和Cd~(2+)对藻体的半数抑制浓度(96 h EC50)分别为0.125和0.551 mg/L;而浓度范围为0–80 mg/L的Pb~(2+)对藻体的生长则表现为低剂量(≤40 mg/L)呈促进,高剂量(≥80 mg/L)则抑制。【结论】从凡纳滨对虾养殖池中分离鉴定出一株形态呈螺旋型的拟柱孢藻,命名为螺旋拟柱孢藻(Cylindrospermopsis raciborskii helix),本藻株活体能够在一定浓度的Cu~(2+)、Cd~(2+)和Pb~(2+)中生长,为螺旋拟柱孢藻活藻生物吸附重金属离子而改善虾池水体环境提供了可能性。     

广东省水库微囊藻的产毒特征和ITS序列的遗传多样性分析

为了解广东省水库微囊藻的产毒特征和ITS 序列的遗传多样性,从广东省供水水库中分离得到28 株微囊藻(Microcystisspp.),对它们的产毒特征和15 株微囊藻的ITS 序列进行了分析.高效液相色谱(HPLC)和微囊藻毒素合成酶基因mcyE 的检测结果表明,广东省水库中的微囊藻以产毒藻株占优势,微囊藻毒素的主要类型为MC-RR.广东省15 株藻株的ITS 序列相似性大于93.2%,在用相邻法(NJ)构建的系统树上,不同形态的种和不同地理区域的藻株没有区分开,产毒和非产毒藻株没有形成独立分支.这说明微囊藻ITS 序列的遗传多样性较低,ITS 序列和mcyE 存在没有相关性,表型不能够反映藻株的进化关系.因此,有必要将藻类传统分类方法与分子方法结合起来对蓝藻进行重新分类.     

两座抽水型水库蓝藻种群与微囊藻毒素的比较分析

2008年每隔两月调查1次广东省两座抽水型水库:凤凰山水库和南屏水库的蓝藻组成与微囊藻毒素分布特征.结果共检测到蓝藻有14属,主要为丝状体和群体种类,常见的有假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、蓝纤维藻属(Dactylococcopsis)、湖丝藻属(Limnothrix)、拟柱孢藻属(Cylindrospermopsis)和色球藻属(Chroococcus).两座水库的蓝藻细胞密度为119～137373 cells mL-1,微囊藻毒素浓度为0～2.26μg L-1.凤凰山水库的全年微囊藻毒素浓度均低于国家安全标准(1 μg L-1),最高浓度出现在3月份;南屏水库在丰水期微囊藻毒素浓度高于凤凰山水库,最高浓度出现在7月(2.26μgL-1).长水力滞留时间的凤凰山水库的蓝藻细胞密度比短水力滞留时间的南屏水库高出1个数量级.两座水库蓝藻细胞密度的峰值都出现在枯水期的3月,这主要与温度和调水量变化引起的营养盐季节性变化有关.假鱼腥藻、湖丝藻和拟柱孢藻是凤凰山水库的优势蓝藻种类,大多数情况下相对丰度超过50%.在南屏水库,枯水期蓝藻以丝状体种类为优势,丰水期则以群体种类为优势.温度和调水量的季节性变化引起的营养盐季节性变化可能是引起南屏水库不同生活类型优势蓝藻种类季节演替的主要因素.     

虾池拟柱胞藻爆发的生态因子调查

2002～2003年,在广东珠三角地区凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)低盐度养殖虾池水体生态的调查过程中发现部分虾池爆发拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii).在调查的低盐度虾池中,共统计20个拟柱胞藻爆发的虾池,其种群密度平均高达7.74×10⁷ filaments·L^-1,平均优势度达47.0%.虾池水体平均水温为30.3℃,pH为8.9,盐度1.4,透明度19cm,化学耗氧量为24.3mg·L^-1.拟柱胞藻爆发的虾池水体环境表现为高水温、高pH、高有机质、低盐度且水体不断被搅动;通常爆发在对虾养殖的中后期富营养化水体.调查发现大量的拟柱胞藻对虾池其它藻类和微生物菌群表现一定的抑制作用,蓝纤维藻和小环藻等少数藻种可与拟柱胞藻形成共优势种.拟柱胞藻为广东珠三角凡纳滨对虾低盐度虾池重要优势藻种,且以螺旋型为主.     

中国沿海新报道的三种产毒拟菱形藻

为了明确我国海域拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia)物种的产毒特征, 从中国沿海建立了15个拟菱形藻单克隆培养株系, 利用高效液相色谱-质谱联用法对其多莫酸特征进行检测, 在10个株系中检测到多莫酸。结合光学显微镜下的群体特征和透射电镜下的超微形态学特征, 以及基于核糖体转录间隔区的分子系统学数据, 确认上述10个产毒株系分别隶属于3个物种:尖细拟菱形藻P. cuspidata、伪柔弱拟菱形藻P. pseudodelicatissima、伪善拟菱形藻P. fraudulenta, 其中伪善拟菱形藻是我国的新记录种。建立尖细拟菱形藻的11个尖细拟菱形藻株系, 其中3个株系未检出多莫酸, 其余8个株系有检出, 单细胞产毒水平为0.4—5.5 fg。建立伪柔弱拟菱形藻株系2个, 1个未检出多莫酸, 另1个株系的单细胞产毒量为1 fg。建立伪善拟菱形藻株系2个, 纯种培养株系均未检出多莫酸。利用卤虫(Artemia salina)对部分藻株进行混培诱导, 其中尖细拟菱形藻(MC4049)和伪柔弱拟菱形藻(MC3015)的产毒水平略有下降, 单细胞产毒水平分别由2、1 fg降至0.2、0.4 fg, 而伪善拟菱形藻(MC4074)的产毒能力则有显著改变, 单细胞产毒水平由未检出上升至17.5 fg。研究丰富了我国产毒拟菱形藻的物种多样性, 明确了其物种信息和产毒水平, 可为后续深入研究提供基础数据。     

分离自蜻蜒虫草的拟青霉属一新种

本文描述了拟青霉属(Paecilomyces)一新种—蜻蜓拟青霉(P. odonatae),该菌分离自蜻蜓虫草(Cordyceps odonatae),与其它种的典型区别特征是它具有拟青霉型产孢结构,产椭圆形链状排列的分生孢子和枝顶孢霉型产孢结构,产柱状粘成团排列的分生孢子.     

珠海地区小型抽水型与非抽水型水库的浮游植物群落结构变化

2006年4月、8月、12月对珠海3座抽水型水库和3座非抽水型水库的水质和浮游植物进行采样和测定.抽水型水库和非抽水型水库的浮游植物分别有67种和56种.蓝藻门的假鱼腥藻(Pseudanabaena sp.)、湖丝藻(Limnothrix redekei)和拟柱孢藻(Cylindrospermopsis rackiborskii)仅在抽水型水库中检到,而绿藻门的鼓藻(Cosmarium sp.)仅在非抽水型水库中检到.抽水型水库浮游植物种类的季节变化比非抽水型水库明显,且浮游植物的丰度和生物量均高于非抽水型水库.抽水型水库浮游植物丰度在1.25×105～4.38×106cells L-1之间,以蓝藻和小型绿藻为主;非抽水型水库浮游植物丰度在7.1×104～4.61×106cells L-1之间,以绿藻门的鼓藻为主.抽水型水库浮游植物的生物量在2.3～8.8 mgL-1之间,非抽水型水库浮游植物的生物量在1.3～5.6 mgL-1之间.抽水型水库浮游植物的生物量在冬春季高于夏季,而非抽水型水库浮游植物的生物量动态相反.抽水型水库浮游植物的优势种具有明显的季节变化.非抽水型水库浮游植物具有相对稳定的群落季节变化,其优势种的组成较为稳定.对于抽水型水库而言,咸潮前期集中调水入库,不仅改变了水库的营养盐负荷,也改变了水库水动力学的季节动态,这也是导致抽水型与非抽水型水库在浮游植物群落结构与动态上存在明显差别的关键因素.     

N-苯基-2-萘胺对拟柱胞藻生长、抗氧化酶及光合系统Ⅱ的影响

为探究化感物质对入侵水华蓝藻-拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)的影响, 研究对不同浓度(0、0.05、0.10、0.50、1.00和2.00 mg/L)N-苯基-2-萘胺处理下拟柱胞藻的生长、抗氧化酶活性及叶绿素荧光诱导动力学进行了测定。结果表明, 藻叶绿素a含量随N-苯基-2-萘胺浓度升高而显著降低, 浓度大于0.50 mg/L时, 拟柱胞藻叶绿素a含量显著低于对照。72h, N-苯基-2-萘胺对拟柱胞藻的EC50为1.02 mg/L。叶绿素荧光诱导动力学参数表明, 浓度小于0.50 mg/L时, 拟柱胞藻的最大光化学效率(P0)、单位面积上有活性的反应中心(RC/CS0)、以吸收光能为基础的性能指数(PIABS)及以单位面积为基础的性能指数(PICS)均显著高于对照, 而反映2ms时有活性的反应中心的开放程度的0则显著低于对照组。当N-苯基-2-萘胺浓度大于0.50 mg/L时, 以上参数均呈现相反趋势。这表明低浓度N-苯基-2-萘胺能提高拟柱胞藻的光合效率, 而在高浓度时, 拟柱胞藻PSⅡ有活性的反应中心减少, 电子传递受到阻碍, 光合效率下降。与对照相比, 在浓度高于0.50 mg/L条件下, 拟柱胞藻的过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活性显著增加, 表明拟柱胞藻能产生大量的抗氧化酶来减少N-苯基-2-萘胺的损伤。这些结果表明N-苯基-2-萘胺可能通过抑制PSⅡ的电子传递和减少其有活性的反应中心来影响拟柱胞藻的生长, 也暗示了N-苯基-2-萘胺能作为潜在的抑藻物质来控制拟柱胞藻水华。       

热带直流型水库蓝藻季节变化特征

于2004年调查了广东省飞来峡和深圳两座直流型水库的蓝藻季节分布特征。共检到蓝藻17属,绝大多数为丝状体种类。常见属有假鱼腥藻(Pseudanabaena)、微囊藻(Microcystis)和蓝纤维藻(Dactylococcopsis)。蓝藻细胞密度为5-2052个细胞ml-1。深圳水库最高蓝藻细胞密度出现在6月,其中丝状蓝藻的相对丰度在75%以上;飞来峡水库最高蓝藻细胞密度出现在12月,丝状蓝藻的相对丰度达到90%。水动力学条件是限制蓝藻丰度和种类的主要环境因子。由于飞来峡水库的水力滞留时间变化较大,所以蓝藻季节性变化受水动力学条件的影响比深圳水库的大。假鱼腥藻等丝状蓝藻更适合在水库中生长,特别是在氮磷营养水平较高,水力滞留时间明显增加时,其细胞密度将大幅度上升。     

丝状蓝藻长孢藻属的中国一新记录种——蒙氏长孢藻

近期在湖北省陆水水库进行野外调查时发现了在中国尚未报道的蒙氏长孢藻Dolichospermum mendotae（Trelease）Wacklin,et al.2009。文章详尽地描述了该种的特征,并对其16S rRNA基因测序分析表明,与日本、西班牙、捷克等地区所得到的该种的序列相似度很高,显示出来自不同地区的蒙氏长孢藻在分子系统进化树上聚为一支。最后通过毒素分子检测和生物试验显示分离于陆水水库的三株蒙氏长孢藻不产神经毒素。     

柱孢鱼腥藻固氮酶防氧的呼吸保护

柱孢鱼腥藻生长在缺氮情况下,发现其固氮活性增加的同时也减少了对氧的敏感性。缺氮生长细胞的乙炔还原活性给氧抑制一半时的氧分压(pO2)是0．5atm．,而有氮生长细胞的半抑制浓度为0．35atm．。这表明蓝藻有可能通过增加呼吸耗氧而提高了它的固氮酶活性。呼吸作用与固氮酶活性之间存在着密切的关系。无论在有氮、缺氮还是光诱导固氮酶形成的情况下,其固氮活性均随着呼吸速率的变化而变化。本研究结果,支持了柱孢鱼腥藻固氮酶的主要防氧手段是呼吸保护的观点。     

CO2浓度变化对拟柱胞藻生长与光合作用的影响

为了探讨大气CO₂浓度升高对水华藻类的影响,利用水华蓝藻-拟柱胞藻作为实验材料,研究了CO₂浓度升高对其生长生理和光合作用的影响,结果表明CO₂浓度升高,导致拟柱胞藻的生物量、最大光合放氧速率、光合效率显著增加。当CO₂浓度为700 mg/L以下,暗呼吸速率和光饱和点无明显影响,而CO₂浓度为1000 mg/L时,暗呼吸速率和光饱和点显著提高。随着CO₂浓度增加,藻细胞光合作用对无机碳的亲和力降低,同时胞外碳酸酐酶活性显著下降。这表明大气CO₂浓度的增加,有利于拟柱胞藻的生长和光合,进而增加了水华发生的风险。     

温度、光照、盐度与pH 对淡水蓝藻拟柱胞藻生长的影响

拟柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)是近年来发现能够引起水华的一种优势淡水蓝藻, 可产生蓝藻毒素,由其引发的水质危害已逐渐引起人们的重视。为探讨环境因素与拟柱胞藻生长状态的关系, 设计采用温度(25, 30, 35 ℃)、光照(2000, 3000, 4000 lx)、盐度(0, 4, 8)与pH 值(7.2, 8.2, 9.2)四种环境因子三水平正交试验, 分析在不同环境因子条件下拟柱胞藻的比平均生长速率, 最高藻丝密度, 叶绿素a(Chl-a)及类胡萝卜素(Carotenoid)含量。研究结果表明, 在9种环境因子组合中, 除温度25℃、光照4000 lx、pH 9.2 及盐度8, 拟柱胞藻不能生长外, 其余条件均能生长。藻丝生长速率、藻丝密度及光合色素的影响程度上, 盐度影响最大, 其次是pH 和温度, 光照影响最小。拟柱胞藻藻丝最佳生长的环境条件为温度30℃, pH 8.2, 光照4000 lx 及盐度0。     

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白亚基和F_(678)色素蛋白

柱孢鱼腥藻的藻蓝蛋白包含有两个亚基。β亚基具有578nm吸收峰和600nm荧光发射峰,分子量19.80±0.40KD,可表明β亚基仅有一个载色团。α亚基具有578nm和630nm吸收峰及645nm的荧光发射峰,分子量17.35±0.38,α亚基可能有两个载色团。别藻蓝蛋白有635nm和650nm吸收蜂及664nm的荧光发射峰。具藻胆体的类囊体膜从高盐浓度缓冲液移至低盐浓度缓冲液时表现678nm荧光发射峰,可能柱孢鱼腥藻存在的F_(678)色素蛋白相当于GLazer(1975)的别藻蓝蛋白B。     

不同pH和盐度下海洋细菌对赤潮藻生长和产毒的影响

研究了在可控生态条件下。一株分离自厦门西海域沉积物的海洋细菌S10在不同pH和盐度条件下对赤潮原因种塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)生长和产毒的影响．结果表明。实验用藻株适宜生长pH为6～8,适宜盐度为20～34;该藻株在不同pH及不同盐度条件下,藻细胞毒力差异显著,且随着pH升高而下降。随着盐度增加而加大,到盐度为30时达到最高值。然后逐渐下降;菌株Sl0(1．02×10^l0cells·ml^-1)在pH7～9和盐度15～34下均能有效抑藻生长和产毒。且在pH7、盐度34时其抑藻生长作用最强;在pH7时抑藻产毒效果较好,且其抑藻产毒作用强度不随盐度变化而异．     

荧光原位杂交技术和流式细胞仪用于环境样品中产毒及非产毒微囊藻的定量监测

全球范围内,高频次、大范围暴发的蓝藻水华对淡水水体环境造成严重影响.微囊藻因其在生长特别是衰亡过程中向水体释放微囊藻毒素而威胁人类健康.因此,分析其产毒株及非产毒株在环境样品中的组成,建立产毒蓝藻的预报及评价体系显得极为重要.本文采用荧光原位杂交技术结合流式细胞技术实现对环境样品中产毒藻株的鉴别与定量.针对目标基因mcyA设计的、以地高辛标记的双链DNA探针可有效应用于产毒微囊藻FACHB905和PCC7806的鉴别.分别对来自滇池、太湖和关桥的11个样品进行分析显示,该方法与传统的形态学鉴定及PCR方法有较好的匹配.荧光原位杂交技术与流式细胞相结合可有效鉴别产毒与非产毒微囊藻,尤其可以对野外样品中产毒与非产毒藻株进行简便、可视化地鉴别,从而达到对产毒微囊藻水华早期预警的目的.