玉米雄性不育的基因表达与调控 Ⅰ.克隆化玉米线粒体DNA的离体转录

我们用克隆化的玉米线粒体DNA(mtDNA)为转录模板,以玉米RNA聚合酶B为转录酶建立起一个无细胞离体转录系统。这是首次用克隆化DNA为模板,以植物RNA聚合酶B建立起的无细胞离体转录系统。     

玉米雄性不育的基因表达与调控

前文我们已报道了玉米RNA聚合酶B对 克隆化玉米mtDNA 的离体转录Ul。本文介绍 对克隆化玉米线粒体DNA (mtDNA）有高转 录活性的玉米RNA聚合酶B的制备方法。从 萌发,天的玉米芽中提取RNA 聚合酶的粗提 物,再经过离心、硫酸按沉淀、DEAE一纤维素及 Sephadex-G 100柱层析、甘油梯度离心等步骤, 使酶纯化了1,000倍,回收率为27%（表1     

RNA聚合酶的模板特异性

研究了多种动物、植物、酵母及细菌RNA聚合酶对不同DNA模板的转录活性,结果表明,各种RNA聚合酶都表现出对同源模板比对异源模板具有更高的转录活性;对热变性DNA比对天然DNA有更高的转录活性。用混合DNA作为转录模板时,玉米RNA聚合酶B和615小鼠RNA聚合酶B都能优先转录其同源模板。     

玉米黑粉菌mtDNA的研究 Ⅱ.限制性内切酶酶切图谱

本文报道玉米黑粉菌mtDNA的限制性内切酶酶切图谱。分别将mtDNA的Bam HI各片段制成探针,与mtDNA分别用8种酶酶切后的Southern膜进行杂交,用片段重叠法得出各套片段的排列次序,再将克隆化的Bam HI片段进行第二酶切,按分子量拼排出各酶酶切位点在mtDNA上分布的图谱。此外,片段重叠分析时,还发现玉米黑粉菌mtDNA为环状结构;杂交分析时还发现mtDNA内没有明显的重复序列。DNA总长60.7kb。     

依赖于DNA的RNA聚合酶研究 VII.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很 多报道〔3,41。但是以高等植物为材料研究RNA 聚合酶远不如其他真核生物多，在植物细胞中 RNA聚合酶B（或11）的含量比RNA聚合酶A 和C要丰富，而且性质也比较稳定IS]，这对研究 RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中 的作用是很有利的。我们以玉米自交系黄早4 为材料，提取了RNA聚合酶B。本文将报道植 物RNA聚合酶B的分离和纯化，并研究这种酶 的性质和功能。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究——Ⅴ.615小鼠肝RNA聚合酶B(Ⅱ)的免疫学特性研究

用615小鼠肝RNA聚合酶B免疫母鸡获得了抗血清。在免疫扩散实验中,这种抗血清和615小鼠肝RNA聚合酶B之间形成清晰的沉淀线;与L615(可移植性小鼠白血病)小鼠及大鼠肝RNA聚合酶B之间形成弱的沉淀线;而与615小鼠肝RNA聚合酶A和C以及大肠杆菌RNA聚合酶之间不形成沉淀线。这种抗血清对615小鼠肝RNA聚合酶B离体转录活性有明显的抑制作用,而对大肠杆菌的RNA聚合酶没有抑制作用。在免疫扩散实验中,这种抗血清可以和不同批号的615小鼠肝RNA聚合酶B产生沉淀线。 这种抗血清和615小鼠肝RNA聚合酶B形成免疫沉淀后的离心上清液电泳图谱中,血清免疫球蛋白的区带消失了。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究 Ⅲ.615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞RNA聚合酶B的比较研究

研究了正常的615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞的RNA聚合酶B,发现两种肝细胞的RNA聚合酶B都可能存在着结合状态和游离状态的形式。在电泳图中L615 RNA聚合酶B有两条电泳区带是615 RNA聚合酶B所没有的。两种B酶的最适铵离子浓度都是90mM;最适锰离子浓度为2mM;镁离子的激活作用在10mM以下时,酶活性随镁离子浓度增高而增强。两种RNA聚合酶B对α-鹅膏蕈碱的抑制作用都非常敏感,而L615 B酶更敏感一些。两种RNA聚合酶B都适于利用变性的单链DNA作转录模板。     

依赖于DNA的RNA聚合酶研究 Ⅶ.玉米胚RNA聚合酶B性质的研究

真核细胞的RNA聚合酶的研究已经有很多报道。但是以高等植物为材料研究RNA聚合酶远不如其他真核生物多,在植物细胞中RNA聚合酶B(或Ⅱ)的含量比RNA聚合酶A和C要丰富,而且性质也比较稳定,这对研究RNA聚合酶B的性质和它在结构基因表达中     

γ-射线对大鼠小肠粘膜上皮细胞RNA合成的影响及其机理的研究

本文观察了15戈瑞γ-射线全身照射后,大鼠小肠粘膜上皮细胞核体外转录活性,从染色质结合的RNA聚合酶和可溶性RNA聚合酶活性变化探讨辐射对核转录活性的抑制机理。实验结果表明:(1)照后2小时、8小时和24小时,核转录活性分别下降22.7％、20.8％和28.2％;(2)染色质结合的RNA聚合酶活性变化与细胞核转录活性变化基本平行,提示核转录活性降低与核内染色质损伤有关;(3)照后24小时,核分离的可溶性RNA聚合酶抑制58％,提示辐射至少部分是通过抑制RNA聚合酶而影响细胞核转录活性;(4)在细胞核和分离的RNA聚合酶都观察到RNA聚合酶Ⅱ抑制程度大于RNA聚合酶Ⅰ和酶Ⅲ,酶活性下降主要表现在RNA聚合酶Ⅱ提示不同类RNA聚合酶对辐射的敏感性不同,酶Ⅱ对辐射更敏感。     

线粒体转录延伸因子:调控线粒体DNA复制与转录转换的分子开关

线粒体转录延伸因子(TEFM)最早是基于其氨基酸序列与真核细胞核转录因子Spt6具有同源性而被鉴定,其包括两个串联重复的螺旋-发夹-螺旋结构域(Helix-Hairpin-Helix,(HhH)2)和一个RNase H折叠。TEFM二聚化对于TEFM与线粒体RNA聚合酶的结合至关重要。近年的研究发现,TEFM是调控线粒体DNA(mtDNA)复制与转录相互转换的关键分子开关,参与人类线粒体基因转录延伸过程及其表达调控。本文首先介绍了TEFM蛋白的序列同源性、蛋白质结构特征,为后续功能研究奠定结构基础。其次,阐明了TEFM在线粒体转录延伸过程中的作用和抗转录终止功能,以及线粒体转录延伸复合体的功能。TEFM避免了mtDNA转录和复制过程发生冲突,使线粒体转录延伸复合体具有更高的稳定性和持续合成能力,体内和体外都能增强mtDNA转录延伸活性,在mtDNA的复制和转录调控中发挥重要作用。最后,阐述了TEFM参与线粒体RNA加工,以及在线粒体能量代谢和线粒体相关疾病的发生发展中的作用。TEFM的缺失严重损害氧化呼吸链,证明mtDNA转录延伸对于维持线粒体氧化磷酸化功能是必需的。1型神经纤维瘤、胰腺癌、脑胶质瘤等疾病的发生机制可能与TEFM基因缺失或表达异常有关,因此,本文进一步探讨和展望了TEFM对人类线粒体相关疾病研究的应用前景。     

狼疮La蛋白的分子生物学研究进展

狼疮La蛋白,又叫La核糖核蛋白、La自身抗原或干燥综合征B型抗原,是原发性干燥综合征的特异性自身抗原之一。La蛋白拥有多种结构和运输元件,可定位于不同的亚细胞部位与RNA相互作用。通常I丑蛋白主要存在于细胞核内,作为RNA聚合酶Ⅲ的转录因子,与RNA聚合酶Ⅲ转录新生产物结合,调节其转录终止,在转录后发挥分子伴侣作用,稳定RNA前体并促进其正确折叠,帮助其进行加工处理。La蛋白还可以与一类拥有内部核糖体进入位点的细胞内mRNA和病毒RNA结合,调节这类RNA的表达翻译;也可在细胞凋亡时被颗粒酶B酶解,产生特异性酶解片段,诱导特异性抗La自身抗体和干燥综合征的生成。我们就I丑蛋白的分子生物学方面的近期研究进展进行综述。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究——Ⅳ.615小鼠和白血病615小鼠(L615)肝细胞RNA聚合酶B的结构分析

真核细胞转录是一个极为复杂的过程,有很多迄今尚未研究清楚的因子参加。依赖于DNA的RNA聚合酶(E.C.2.7.7.6)直接或间接地和转录的调节过程有关。真核细胞有三种结构不同的KNA聚合酶,它们有不同的转录功能。因此,研究真核细胞RNA聚合酶的结构对弄清酶对转录和调节显得十分重要。     

大鼠小肠粘膜上皮细胞体外转录系统

作者用改良的Bronstein法分离纯化大鼠小肠粘膜上皮细胞核,建立了粘膜上皮细胞核、染色质和RNA聚合酶体外转录系统,并对它们的转录活性和某些因素的影响进行了一些比较研究。实验结果提示肝素可提高细胞核、染色质的转录活性,抑制分离的可溶性RNA聚合酶活性。鹅膏蕈碱可抑制核和染色质转录活性。精胺在低浓度(＜10mmol／L)对RNA聚合酶有加强作用,而高浓度有抑制作用,表明上述系统适用于转录调控的研究。     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。     

依赖于DNA的RNA聚合酶的研究

真核细胞转录是一个极为复杂的过程,有很多迄 今尚未研究清楚的因子参加。依赖于DNA的RNA 聚合酶^{(E. C. 2.7.7.6）}直接或间接地和转录的调节 过程有关。真核细胞有三种结构不同的RNA聚合 酶^5,6,8,10,11),它们有不同的转录功能。因此,研究真 核细胞RNA聚合酶的结构对弄清酶对转录和调节显 得十分重要。     

色氨酸操纵子调控机理详析

色氨酸操纵子是最早被研究的细菌合成代谢调控、基因表达调控的模型之一。其中阻遏蛋白对转录起始的抑制作用、色氨酸作为辅阻遏物的作用以及通过定点突变揭示的弱化作用的分子机制已基本被阐明。此外,色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白、NusA、NusG、TrpY等调节蛋白对细菌色氨酸操纵子弱化作用的调节机制也在近年来得到进一步揭示。特别是在枯草芽孢杆菌中,色氨酸操纵子主要依赖于转录衰减机制调控,包括由色氨酸激活的色氨酸操纵子RNA结合弱化蛋白与新生转录产物结合形成内部终止子,导致5′非翻译区（5′UTR）转录终止。NusA、NusG通过刺激RNA聚合酶在5′UTR的U107和U144位点暂停,释放出RNA聚合酶,最终造成转录终止。不同的是,在U144位点NusA参与的转录弱化机制依赖其发夹结构,且NusA与RNA聚合酶作用促进了RNA结合弱化蛋白与新生转录产物的结合,使转录终止。而NusG是通过与非模板DNA链中的一段富含T碱基序列和RNA聚合酶同时互作,阻止了RNA聚合酶向下游移动,从而引起RNA聚合酶高效停滞。但在细菌操纵子中,绝大多数调节因子参与的弱化机制最终依赖于ρ因子,从而导致多达一半的转录终止事件发生。近年来,随着学科的发展,越来越多关于色氨酸操纵子调节机制新概念被挖掘报道,这也使人类对色氨酸操纵子的表达调控机制的认知愈加详尽。     

真核基因启动子非依赖的功能转录延伸复合物的体外组装

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的持续合成能力对基因转录过程中每一个阶段,包括启动子脱离、转录暂停、转录终止以及转录偶联DNA损伤修复过程的调节至关重要.在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录延伸过程中,其和模板DNA及转录产物RNA紧密结合,形成一个非常稳定的延伸三维复合物(elongationcomplex,EC).此特征性“泡”状结构的形成是RNA聚合酶Ⅱ持续合成能力所必需的.在不依赖启动子及众多转录起始因子的条件下,利用人工合成的RNA与DNA寡核苷酸,在体外组装形成具有功能转录活性的延伸复合物.结果表明,长度为9个核苷酸的RNA与模板DNA形成的杂合分子对转录延伸复合物的形成是必需的,而非转录模板DNA链的加入导致最终活性转录“泡”状复合物的形成,并可转录形成与模板相关的转录产物,进一步通过在模板DNA的特定位置引入一个乙酰氧乙酰氨基芴修饰基团,可特异性地阻断转录延伸过程,从而显示该系统在研究真核基因转录及转录偶联DNA损伤修复机制中的潜在应用价值.     

不同来源RNA聚合酶对霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用

目的:研究不同来源的RNA聚合酶对预测的霍乱弧菌分型噬菌体VP3启动子的作用。方法:以含有预测的VP3启动子区的片段取代质粒pRL-null的T7启动子区,以海肾萤光素酶基因Rluc为报告基因,在霍乱弧菌N16961内检测霍乱弧菌RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用;将上述重组质粒和表达VP3 RNA聚合酶的质粒共转化大肠杆菌JM109,检测大肠杆菌和VP3的RNA聚合酶对克隆的启动子区的作用。结果:N16961的RNA聚合酶不能识别并作用于启动子P1、P2、P5、P6、P10和P12,JM109的RNA聚合酶可能识别并作用于启动子P7和P11;只有P2、P7、P8、P9、P13、P16和P17在JM109内可以被克隆表达的VP3 RNA聚合酶识别转录。结论:宿主菌N16961与非宿主菌JM109的RNA聚合酶识别转录VP3启动子的能力不同,可能与噬菌体的宿主特异性有关;VP3的RNA聚合酶对大部分有活性的VP3启动子具有直接启动转录作用,但部分启动子可能需要VP3或宿主蛋白的辅助作用才能表现出更强的活性;VP3启动子对VP3 RNA聚合酶的特异性也不同,P1、P2和P12对VP3的RNA聚合酶具有高度特异性,P7和P11的特异性较弱。     

小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶Ⅱ不能转录绒毛烟斑驳病毒及其拟病毒

小麦芽经过匀浆、沉淀、高速及超速离心、透析以及DE_(52)离子交换层析等步骤,纯化小麦芽依赖于DNA的RNA聚合酶。用α-鹅膏蕈碱抑制试验,证明得到RNA聚合酶Ⅱ。用此聚合酶Ⅱ组建的体外转录体系的研究结果表明,绒毛烟斑驳病毒的拟病毒和卫星RNA(黄瓜花叶病毒相关RNA_3)都不能利用该体系进行转录,类病毒PSTV可进行转录,但转录效率明显低于小牛胸腺DNA;α-鹅膏簟碱可抑制类病毒的转录。绒毛烟斑驳病毒拟病毒和卫星RNA都不能被转录,表明他们的复制方法与类病毒不同。