中药杜仲原植物的分子鉴定

杜仲是我国特有贵重中药材,市场供不应求,各地出现许多伪品,为克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足,本研究旨在运用分子标记技术鉴定中药杜仲Eucommia ulmoides Oliv的真伪。采用PCR产物直接测序法测定杜仲原植物matK基因序列,通过Clustal软件将其与GenBank中同源序列进行排序比较,分析杜仲序列特征。结果:测定的杜仲matK序列长度为1140bp,同源序列比较分析表明,杜仲matK序列中存在32个特异性位点,其中特异性A、T、C、G位点分别为8,2,11,11,序列中有一个GAC插入为杜仲所独有。matK基因是良好的分子标记,能够为杜仲原植物鉴定提供足够的特异性变异位点,matK基因序列的测序分析可成为杜仲正品鉴定的有效手段。     

杜仲雄花芽2个发育时期转录组分析

杜仲（Eucommia ulmoides）雄花富含多种活性成分和营养成分,具有重要的药用和营养价值。为了揭示杜仲雄蕊原基发育相关基因的表达情况,为杜仲雄花芽发育分子调控机制研究提供理论参考。本文以杜仲良种"华仲11号"（ "Huazhong No.11" ）为材料,采用lllumina高通量测序技术,分别对苞叶原基分化期和雄蕊原基分化期的花芽进行转录组测序,通过生物信息学对2个发育时期的转录组进行比较分析,筛选出与雄花芽形态发育相关的差异基因。结果显示,转录组测序共获得40.48 Gb过滤数据,各样品的clean reads与杜仲基因组进行序列比对,比对效率为90.56%~93.01%。在2个发育时期筛选出583个差异表达基因,其中在雄蕊原基发育期上调基因315个,下调基因267个。差异基因GO和KEGG功能分析显示,差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关的生物过程和代谢通路。结果显示光周期途径是杜仲成花诱导的重要途径,同时雄花芽在形态分化过程中受碳水化合物、植物激素和其他代谢物质调控。此外,MADS-box家族成员FLC、SOC1、AGL3和AGL8参与杜仲雄蕊器官发育。本研究为杜仲花发育基因调控提供了基础数据,也为雄花用杜仲的分子育种提供了参考。     

基于转录组数据的杜仲红叶性状SSR分子标记分析

对‘华仲12号’杜仲的幼嫩叶片（绿色）和成熟叶片（红色）及‘华仲11号’杜仲成熟叶片（绿色）进行转录组测序,进行测序数据的拼接和组装,且对转录组获得的基因（Unigenes）进行SSR分析。研究得到54 517条平均长度为806.90 bp的Unigenes,其中25 993条Unigenes在Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG蛋白数据库获得功能注释,占所有Unigenes的47.68%。参照KEGG数据库,可将注释到的6 910条Unigenes划分到122个代谢途径分支,其中花色苷代谢途径相关酶基因39个,类黄酮代谢途径38个,类胡萝卜素合成途径34个。54 517条Unigenes中共包含17 010个完整型SSR位点,占总SSR位点的96.28%。完整型SSR位点共包含67种重复基元,其中出现频率最高的重复基元类型为单核苷酸重复中的A/T （7 747个）,其次是AG/CT （5 039个）和AT/AT （850个）从花色苷代谢途径、类黄酮代谢途径及类胡萝卜素代谢途径中共找到13个SSR位点。为今后杜仲遗传多样性分析、遗传图谱构建及杜仲红叶性状分子标记开发等方面奠定了分子基础。     

蝴蝶兰腋芽增殖过程中的转录组特性

蝴蝶兰在种苗生产中主要是以腋芽再生的方式进行繁育。本研究以大辣椒、四季春2个蝴蝶兰品种为试材,利用Illumina Hi Seq-(TM)2000平台对他们在组织培养过程中3个诱导增殖阶段的转录组进行了测序。结果表明,测序共获得52.77 Gb的Clean Data,6个样品的Clean Data平均达到了6.78 Gb。对Clean Data进行过滤并组装,共获得86130条Unigenes;其中长度在1 kb以上的Unigenes有16723条。参照无参基因组在数据库中进行比对分析,其中28430条Unigenes可进行有效注释。对2个品种、3个诱导增殖阶段的全部Unigenes进行SNP分析表明,四季春的杂合性SNP分布密度明显低于大辣椒品种。另外,对转录组数据进行了差异表达基因分析,共获得了7638条差显基因。     

2个石榴品种果皮花色苷合成相关基因表达分析

以2个不同红色石榴品种‘红宝石’和‘墨石榴’为试验材料,采用荧光定量PCR方法,分析花色苷合成相关基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT等6个基因在果实发育过程中的转录表达特性,同时分析基因表达量与果皮花色苷积累的关系。结果表明:(1)在整个果实发育期内‘墨石榴’花色苷含量明显高于‘红宝石’;随着果实的发育,‘红宝石’果皮中总花色苷含量不断增加,而‘墨石榴’中总花色苷含量初期很高,随后迅速下降,后期维持在较低水平。(2)‘红宝石’中CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT等5个基因均在果实发育的早期和晚期出现2个表达高峰,而ANS基因的表达量在整个果实发育期内不断升高;在‘墨石榴’中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等5个基因的表达高峰均出现在早期,随着果实的发育表达量均呈下降变化趋势,但UFGT基因在中期时表达量最高。(3)‘红宝石’石榴的ANS基因表达量与总花色苷含量呈显著正相关,‘墨石榴’中CHS和ANS基因的表达水平与总花色苷含量显著相关。研究认为,花色苷合成相关基因的初期和末期表达差异是2个石榴品种着色差异的主要原因,ANS在‘红宝石’着色中起关键作用,CHS和ANS可能在‘墨石榴’花色苷积累中起重要作用。     

不同牛种STAT5B基因启动子多态性分析

目的:试验旨在筛选STAT5B基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响,为地方牛种选种选育提供一定理论依据.方法:选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点.结果:STAT5B基因5'调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为:T-181C、C-31G、T+119C.生物信息学软件预测得到STAT5B基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致5个转录因子结合位点消失,而产生8个新的转录因子结合位点.软件未发现可能的CpG岛范围,但STAT5B基因RNA二级结构和最小自由能在突变后显著改变.结论:DNA池结合测序技术可快速筛选SNP位点,STAT5B启动子区存在功能性SNP位点.     

火龙果转录组测序、基因表达与功能分析

利用高通量测序技术对火龙果(Hylocereus undulatus Britt)红肉品种‘大红二号’的花芽、果实和枝条不同发育阶段的基因表达进行研究。结果显示,转录组测序共获得468.68 Gb原始数据(Raw data),从头组装获得239 152条转录本和162 519条unigene,约53.74%的unigene得到注释。分别在43 506条和16 251条unigene中检测到600 283个SNP位点和56 147个SSR位点。基因表达分析结果表明,在火龙果不同组织Fl510、Fl513、Fl514、Fl518、F711、F715、S513、S419中分别有31、7、5、152、17、63、17、8个特异表达的unigene。通过GO和KEGG富集分析,发现了一些组织特异的GO条目和代谢通路,如在Fl510中富集的类萜骨架生物合成代谢通路等。本研究还对参与花发育的候选基因进行了鉴定和表达分析,他们包括COL基因、FT-like基因、分生组织决定基因和器官决定基因等。     

石榴果色合成相关基因CHS和CHI的表达特性分析

花色苷是类黄酮家族中重要的一类次生代谢产物,对果实呈色起重要作用。CHS (查尔酮合成酶)和CHI (查尔酮异构酶)为花色苷合成提供了前体物质,是花色苷合成所不可或缺的。利用RT-PCR和RACE方法,本研究从石榴果皮中克隆了与花色苷合成相关的CHS基因和CHI基因的cDNA全长,同时采用qRT-PCR研究了这两个基因在三个不同色泽石榴品种‘红宝石’、‘水晶甜’、‘墨石榴’发育期内的表达模式,并分析了果皮花色苷含量变化与基因转录水平的关系。结果表明,石榴中CHS和CHI基因cDNA全长分别为1 197 bp和693 bp,分别编码398和230个氨基酸,命名为PgCHS和PgCHI,在GenBank中的登录号分别为KF841615和KF841616。在氨基酸水平上,Pg CHS与荔枝、葡萄、山竹等果树的同源性达到90%以上。Pg CHI与果树中龙眼、梨、美洲葡萄、桑树等同源性达到70%以上。qRT-PCR结果显示,CHS和CHI基因的表达模式随色泽发育期和品种不同而有差异。在‘红宝石’石榴中,该两个基因都有前期和后期两个表达高峰期;而‘水晶甜’石榴中这两个基因的表达高峰期均出现在中后期;‘墨石榴’发育初期时CHS和CHI的表达量最高,以后的表达量都较低。同一品种内,CHS和CHI的表达具有协同性,两者的协同性表达有利于花色苷及其他类黄酮相关产物的合成。3个品种中CHS和CHI基因的表达与花色苷的积累并不一致。     

血管内皮生长因子基因3''UTR 不同基因型载体的构建与鉴定

目的:构建含SNP位点的血管内皮生长因子(VEGF)基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为进一步揭示VEGF基因3’UTR的单核苷酸多态性(SNP)影响肺癌发病风险的分子机制奠定基础。方法:以rs3025039和rs3025040两个位点均为C纯合子的非癌症病人血液DNA为模板,扩增出两位点为C/C单体型、长度为1448 bp的VEGF基因3’UTR目的片段,测序验证后将其克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体上,得到重组质粒pMIR-C/C。同时,我们以pMIR-C/C为模板定点突变两个SNP位点,得到具有T/T单体型的重组质粒pMIR-T/T。将各重组质粒转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性克隆后提取质粒进行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:单菌落质粒测序验证显示带有C/C单体型的VEGF基因3’UTR重组质粒pMIR-C/C构建成功;经两次定点突变,成功将pMIR-C/C质粒转变为pMIR-T/T,经测序验证未引入任何其他突变。同时生物信息学预测还显示rs3025040位点位于miR-199a/b与VEGF基因mRNA的结合位置,其改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含有两个连锁SNP的VEGF基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为今后VEGF基因3’UTR的功能研究奠定基础。     

不同产地杜仲树皮可培养内生真菌群落组成和多样性

以湖南、四川、贵州、河南、安徽、江西和陕西7个产地的杜仲Eucommia ulmoides为研究对象,采用可培养法对树皮内生真菌进行分离培养,结合形态学和分子生物学进行鉴定,并分析不同产地杜仲内生真菌群落组成和多样性差异。结果表明,不同产地杜仲树皮中共分离到真菌545株,隶属于7纲、15目、27科、43属,其中间座壳属Diaporthe为7个产地的共有属,各地优势属不同。在属水平上,四川样本中真菌群落多样性最高,河南样本真菌群落多样性最低。Margalef丰富度指数及Pielou均匀度指数表明,在河南样本中的内生真菌分布最均匀,丰富度最低;贵州样本内生真菌丰富度最高,但最不均匀。相似性分析显示不同产地杜仲树皮内生真菌组成和多样性不同。这些结果揭示了杜仲树皮中内生真菌菌群具有丰富的多样性,7个不同产地的杜仲树皮内生真菌群落组成、相对多度及优势类群皆存在差异。     

金针菇交配型B第三个亚位点的发现与遗传

本研究在分析金针菇减数分裂重组热点时发现B交配型位点可能存在第三个亚位点,为此对同核菌株‘6-3’和‘6-21’的B交配型位点进行全基因组注释,获得8对同源信息素受体基因（pheromone receptor gene,pr）和3对同源信息素前体基因（pheromone precursor gene,pp）,组成了2个结构完整、相距326kb的亚位点α和β;‘6-21’菌株还发现1个‘6-3’菌株不具有的pr,组成第3个亚位点γ,它与亚位点α和β没有连锁。‘6-3’和‘6-21’配对形成异核体后出菇,分离获得142个单孢菌株,其B交配型有8种基因型,通过亲和性试验得到证实,同时还验证了第3个亚位点γ具有与α、β相同的功能。     

‘脆红李’果实发育过程中花色苷含量及相关基因表达分析

花色苷是一类重要的色素,对李红色的形成必不可少。本研究以‘脆红李’为试材,研究了果实发育过程中叶绿素含量、总花色苷含量及果皮主要花色苷组分和含量的变化规律,并分析了Ps PAL、Ps CHS、Ps CHI、Ps F3H、Ps DFR、Ps ANS和Ps UFGT基因在果实不同发育阶段的表达规律。结果表明,随着‘脆红李’果实的生长发育,果皮和果肉中总叶绿素含量呈逐渐下降的趋势;‘脆红李’果肉中不含花色苷,果皮中的花色苷在转色期才开始积累,成熟时达到最大值,为404.37μg/(g·FW),并以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷为主;花色苷合成相关基因在‘脆红李’不同生长发育时期的果皮和果肉中有着特异性的表达,但只有Ps PAL和Ps UFGT基因的转录水平与花色苷含量的正相关性达到极显著水平,表明这两个基因对‘脆红李’果实的着色有着异常重要的调控作用。     

7个变异红叶杜仲叶片色素及活性成分分析

为探讨不同变异类型红叶杜仲叶片呈色机理及活性成分含量,以7个不同变异红叶杜仲和绿叶杜仲为材料,对叶片颜色、色素分布、含量及活性成分含量进行测定分析。结果表明：7个变异红叶杜仲叶片正面呈暗红或紫红色,栅栏组织呈红色或暗红色;背面颜色3、5和6号呈红色,下表皮也呈红色,1、2、4和7号为绿色,下表皮透明;7个变异红叶杜仲叶片C_a、C_b和C_T含量均低于对照杜仲叶片,而C_Car、C_F含量以及C_Car/C_T、C_F/C_T值均显著高于对照叶片,叶片色素含量在7个红叶杜仲间也存在一定差异;7个变异红叶杜仲叶片5种活性成分含量均较高,且绿原酸、京尼平苷和总黄酮含量明显高于对照杜仲叶片。叶片中C_F分布、含量及C_F/C_T值是红叶杜仲呈色差异的主要原因,高活性成分含量使其在药用方面有很大的开发利用潜力。本研究可为观赏兼药用杜仲资源选育提供材料。     

基于极端混合池（BSA）全基因组重测序的羽衣甘蓝白色叶基因定位

筛选羽衣甘蓝白色叶形成相关的关键基因和位点以及心叶颜色性状的遗传规律，以羽衣甘蓝红叶亲本WR、白叶亲本WB及其构建的F2分离群体为试验材料，从F2群体中挑选红叶和白叶植株各20株，分别构建2个DNA混合池，对子代混合池和亲本分别开展50×和20×覆盖深度的全基因组重测序，定位白叶性状关联区间，并根据基因注释信息预测候选基因。结果表明，重测序获得3 987 718个单核酸多态性（SNP）标记，获得位于第2、3和9染色体的8个显著关联区间，根据基因注释和功能分析，筛选到8个候选基因（Bol030253、Bol029431、Bol012077、Bol007709、Bol030318、Bol030235、Bol030286和Bol005195）。将8个基因确定为羽衣甘蓝白叶的候选基因，可能在羽衣甘蓝叶片颜色形成过程中起着重要作用。     

利用DNA池技术研究猪GH基因启动子序列的多态性

目的:分析猪GH基因启动子区序列的多态性,期望筛选出对猪生长性状有显著影响的SNP位点,为地方猪种的选育及选种提供一定的理论依据.方法:以大约克、可乐猪、香猪和黔北黑猪为试验对象,构建品种DNA池,采用PCR产物直接测序法对猪GH基因启动子区-856～+171片段共1 027bp进行单核苷酸多态性检测.结果:除香猪外,在其他3个猪种5'-端侧翼序列发现5个SNP位点:C22T、A- 26T、G- 219A、T- 385A和C-391T,并且在大约克GH基因启动子区-640处发现了一个12bp碱基序列(GGCAAAGTGTAG)的缺失.结论:DNA池结合PCR产物直接测序技术能够很好的筛选SNP位点,本研究采用该技术在猪GH基因启动子区- 856～+171片段检测到了5个SNP位点.     

香雪兰花瓣的花色苷组成

为研究不同品种香雪兰的花色苷组成、含量及与花色表型之间的关系,阐明香雪兰花色形成机理,该研究以不同花色的香雪兰(Freesia hybrida) 11个品种为材料,采用英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)和色差仪进行花色描述,利用特征颜色反应初步确定色素类型,通过pH示差法测定花瓣中总花色苷的含量,进而利用UPLC-Q-TOF-MS技术分析各品种花瓣中花色苷种类和相对含量。结果表明:11个所选品种涵盖香雪兰四大色系,即白色系、黄色系、红色系、蓝紫色系;所选品种都含有黄酮类化合物,不含或含有极低量的类胡萝卜素,除‘White River’‘Fragrant Sunburst’‘Gold River’‘Tweety’外,均含有花色苷;‘Red Passion’花瓣中总花色苷含量最高,最低是‘Lovely Lavender’,其含量仅为‘Red Passion’的24%;在香雪兰花瓣中共检测出10个花色苷组分,分别为飞燕草-二葡萄糖苷、矢车菊素-二葡萄糖苷、矮牵牛素-二葡萄糖苷、飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-二葡萄糖苷、锦葵素-二葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷、芍药素-3-O-葡萄糖苷、锦葵素-3-O-葡萄糖苷;红色系品种‘Red Passion’和‘上农红台阁’花瓣中主要成分为矢车菊素类化合物,蓝紫色系品种‘Pink Passion’‘Castor’‘上农淡雪青’和‘上农紫玫瑰’花瓣中主要成分为矮牵牛素类和锦葵素类化合物,‘Lovely Lavender’花瓣仅含飞燕草素类化合物。研究表明不同品种香雪兰花瓣颜色的呈现与花色苷种类有关,花瓣着色程度则与花瓣中花色苷总含量成正比。该研究结果为新品种培育、花色改良和育种工作提供理论依据。     

三倍体香蕉优良品种‘Grand Nain’全基因组变异挖掘

为全面揭示香蕉(Musa spp.)优良品种的全基因组变异类型,本研究采用高通量重测序技术,对当前香蕉主栽品种‘Grand Nain’(AAA group,Cavendish subgroup)开展全基因组重测序,测序深度53.79 X。与野生香蕉‘DH-Pahang’参考基因组比对,共检测到4 598 633个单核苷酸多态位点(SNP),484 752个小片段插入缺失位点(Indel),57 047个结构变异(SV),共导致36 277个基因变异;代谢通路分析(KEGG)发现,植物激素信号转导途径相关基因的变异最多,存在442个基因变异,其中乙烯合成和信号转导途径中1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO)、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因(ACS)、EIN3/EILs、ERS、RAN、EBF、EIN2等基因都存在变异。特别是序列分析发现‘Grand Nain’中的Ma ACO1基因与参考基因组相比存在2个变异位点并导致氨基酸的突变,且在A和B基因组中MaACO1基因存在2个相邻的变异位点。本研究为香蕉贮藏保鲜等相关分子标记开发、基因功能研究,以及基于基因组编辑技术的香蕉遗传改良提供依据。     

水稻糯性相关基因的全基因组关联分析

利用1 090 071个SNP标记, 对419份广西地方稻种资源核心种质的糯性进行全基因组关联分析。结果表明, 运用混合线性模型, 在P<4.72×10^-8 (4.72E-8)水平下, 检测到45个与糯性显著关联的SNP位点, 均位于第6号染色体上。通过筛选显著关联位点上、下游各150 kb区域内的基因, 共找到305个候选基因, 其中包含2个与淀粉合成酶相关的Wx和SSIIa基因; 同时在第6号染色体5.69-5.89 Mb区域发现4个与糯性显著关联的SNP位点, 该区域可能是影响水稻(Oryza sativa)糯性的重要候选区域。     

桂花查尔酮异构酶OfCHI基因的克隆与表达分析

查尔酮异构酶CHI是花青素苷合成途径中的关键酶。为了解桂花花青苷的合成机理,该研究对3个桂花品种的花青苷含量进行了测定。结果显示:(1)‘橙红丹桂’花中的花青苷含量最高,‘金桂’和‘早银桂’中花青苷含量较低。(2)利用RACE和RT-PCR方法获得了桂花查尔酮异构酶基因(OfCHI)的全长cDNA序列1 069bp,该基因编码248个氨基酸,相对分子量为26.85kD,等电点为6.34。(3)多重序列比对显示,OfCHI与金花茶CnCHI、忍冬LjCHI、石榴PgCHI的相似性分别为68.13%、65.86%和63.53%,氨基酸序列中含有CHI蛋白的活性位点Thr47、Tyr108、Met115以及Ser192;系统进化树分析表明,OfCHI与其他物种起源相同,而与油橄榄OeCHI亲缘关系最近。(4)利用qRT-PCR对不同桂花品种、不同组织中OfCHI的表达量检测结果显示,OfCHI在‘橙红丹桂’花中表达量最高,在‘金桂’和‘早银桂’中表达量较低;OfCHI在‘橙红丹桂’、‘金桂’和‘早银桂’的花、茎、叶中均有表达,且表达趋势相同,均为叶中表达量最高。该研究为揭示桂花青素苷的合成机理奠定了理论基础,并为培育不同花色的桂花新品种提供了基因专利。     

基于简化基因组测序的大黄鱼耐高温性状全基因组关联分析

利用Illumina HiSeqTM 2500测序平台, 对通过高温胁迫实验筛选得到的20尾耐高温和20尾不耐高温的大黄鱼(Larimichthys crocea)进行了简化基因组测序(SLAF-seq), 每个样本的平均测序深度达到10.26×, 共获得419211个高质量的群体单核苷酸多态性(SNP)位点 。利用TASSEL软件的混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析(GWAS), 共筛选到38个与大黄鱼耐高温性状显著相关的SNP位点(P<2.39E–08)。利用BLAST程序定位每个SNP位点在大黄鱼基因组中的位置, 并分析其周围的功能基因。结果在38个SNPs附近共找到26个已知的功能基因, 这些基因主要与细胞转录、代谢、免疫等功能相关。研究结果可为下一步大黄鱼耐高温分子机制解析及耐高温品种的选育提供参考。