拟南芥HyPRP蛋白AZI1在转基因烟草中的亚细胞定位及其对灰葡萄孢的抗性

通过农杆菌转化法得到了整合有拟南芥AZII基因的烟草植株,进一步利用转基因烟草分析了AZI1蛋白的亚细胞定位及其对真菌病原体的抗性特征。在上下游引物5’端分别引入NcoI和SpeI酶切位点,采用高保真耐热DNA聚合酶彤Pfu从拟南芥Co1-0生态型基因组DNA扩增AZII基因的编码序列,用NcoI和Spel对扩增片段和pCAMBIA1302质粒载体进行双酶切,通过T4DNA连接酶构建产生AZII-GFP融合表达载体。用包含融合表达载体的农杆菌细胞转化烟草叶片,经潮霉素选择获得了完整的再生植株,并收取了T。代种子。激光共聚焦显微观察发现,AZI1蛋白主要定位于细胞表面。病原体侵染结果显示,AZI1基因能够明显提高烟草对灰葡萄孢的抗性。说明AZI1蛋白通过分泌途径被定位到细胞表面后,能够抑制真菌病原体对植物组织的侵染过程。     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

利用转基因烟草确定AtELHYPRP2蛋白对赤霉菌的抗性及其亚细胞定位特征

采用遗传转化技术获得了整合有拟南芥AtELHYPRP2(EARLI1-LIKE HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN 2,AT4G12500)基因的转基因烟草株系,研究了该基因编码蛋白对真菌病原体赤霉菌的抗性及其亚细胞定位特征。以拟南芥Col-0生态型基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增AtELHYPRP2基因编码序列,经限制性酶切后连接至pCAMBIA1302载体,构建产生pCAMBIA1302-AtELHYPRP2-GFP融合表达载体。进一步采用农杆菌LBA4404转化烟草叶片外植体,筛选得到转基因烟草植株。RT-PCR、Western blotting印迹分析结果显示,AtELHYPRP2基因在转化体中可以有效表达。激光共聚焦显微观察发现AtELHYPRP2-GFP融合蛋白产生的绿色荧光与碘化丙啶染色后产生的红色荧光能够重合,说明AtELHYPRP2蛋白定位于细胞表面。真菌侵染实验结果显示,组成性表达AtELHYPRP2基因能够增强烟草对赤霉菌的抗性,被侵染部位有明显的H2O2积累。转基因烟草植株中PR1基因的本底表达水平比野生型高,PR1和PR5基因的系统表达水平比野生型高,说明AtELHYPRP2基因可能在SAR反应中具有一定的作用。     

拟南芥血红蛋白1的亚细胞定位

为研究拟南芥的血红蛋白1(AtGLB1)基因的亚细胞定位,该实验构建了拟南芥血红蛋白1基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体pUCGFP/ AtGLB1.利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白1在细胞中的定位.荧光显微镜检测结果表明,AtGLB1基因表达产物主要定位在细胞核中,少量定位在细胞质中.     

烟草氧化胁迫相关基因NtOSA1的克隆表达及亚细胞定位分析

植物类蛋白激酶Abc1家族(activity of bc1complex)在植物生长发育及响应非生物胁迫中起着重要的作用。该研究通过将拟南芥AtOSA1蛋白氨基酸序列与烟草转录组数据进行比对,利用巢式PCR技术克隆得到1个烟草氧化胁迫相关Abc1家族基因NtOSA1,NtOSA1与拟南芥AtOSA1基因具有72.89%的一致性。NtOSA1基因开放阅读框长度为2 283bp,编码760个氨基酸,含有典型的ABC1结构域、一个激酶结构域、叶绿体定位信号肽和两个跨膜结构域。采用实时荧光定量PCR技术,对NtOSA1基因在烟草不同组织以及氧化胁迫、盐胁迫等处理下的表达分析表明:NtOSA1基因的表达具有组织特异性,主要在叶片中表达;NtOSA1基因在H2O2和NaCl处理后表达量上升,均在处理后6h达到最大值,分别为处理前的1.95和2.69倍。亚细胞定位结果表明,NtOSA1蛋白定位在细胞叶绿体上,与预测结果一致。研究表明,NtOSA1基因参与了烟草抗氧化胁迫和盐胁迫的响应。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的cDNA序列,设计合成了Ap5和Ap3两个引物,应用RT－PCR技术扩增了拟南芥的ABP基因。将该基因克隆在植物表达载体p35SSIN的35S启动子和Nos3’端之间,得到植物表达载体p35SE。通过农杆菌个导的方法对烟草SR1进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

拟南芥血红蛋白3的亚细胞定位

拟南芥的血红蛋白3（AtGLB 3）属于截短的血红蛋白。与拟南芥血红蛋白1相比,拟南芥血红蛋白3具有不同的起源、不同的生化特性和结构;但其功能还不清楚。蛋白质的定位与蛋白质的功能息息相关。为深入研究该基因功能,构建了拟南芥血红蛋白3基因与绿色荧光蛋白融合的植物表达载体pUCGFP/AtGLB3。利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞瞬时表达,通过检测融合蛋白在洋葱表皮细胞中的分布来确定拟南芥血红蛋白3在细胞中的定位。荧光显微镜检测结果表明,AtGLB3基因表达产物主要定位在细胞膜上。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

拟南芥AZI1基因对酿酒酵母细胞生长和蒜薹灰霉菌侵染的抑制作用

本工作采用酿酒酵母细胞表达载体pESC和植物细胞表达载体pPZP211分析了拟南芥AZI1基因对真菌的抗性功能。半乳糖诱导产生的AZI1蛋白可以使酵母细胞的生长能力明显降低。DAB和台酚蓝染色结果显示用蒜薹灰霉菌孢子处理Col-0野生型植株叶片后被侵染部位只能产生少量H2O2,病原体可以扩散,而AZI1基因过表达植株叶片在侵染部位有大量H2O2产生,着色较深,表明转化体能够以局部细胞的死亡来阻止病原体侵染周围的细胞。在Col-0野生型植株中,AZI1基因的表达受外源水杨酸诱导,24h后达到峰值。以上结果说明AZI1基因在拟南芥对生物胁迫因素的应答过程中具有重要作用。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacun)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I_2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色,显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后,采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长, 构建了原核表达载体, 转入大肠杆菌(Escherichia coli)中, 使用IPTG于28°C诱导6小时后, 通过SDS-PAGE检测到目的蛋白, 分子量约为55 kDa, 并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体, 通过农杆菌(Agro- bacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察, 发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I₂-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色, 显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后, 采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。     

转录因子DREB2A植物表达载体构建及烟草转基因研究

构建转录因子DREB2A基因表达载体,通过叶盘法进行烟草的转基因表达研究。经过抗生素卡那霉素抗性筛选-PCR鉴定-Southern杂交检测,表明目的基因已经整合到烟草基因组DNA中。转基因植株出现生长迟滞现象。     

Expression of His-tagged Shigella IpaC in Arabidopsis

Although the expression of histidine (His)-tagged proteins in bacteria is routine, few His-tagged proteins have been expressed in plants, and no His-tagged proteins from bacterial pathogens have been expressed in plants, to our knowledge. Here, we demonstrate expression of the Shigella flexneri invasion plasmid antigen, IpaC, in Arabidopsis thaliana. S. flexneri is the causitive trigger for bacillary dysentery, and IpaC is essential for bacterial entry into epithelial cells. IpaC, attached to a 5' leader containing six tandem His codons, was cloned into a pBI121 vector. This clone was introduced into Agrobacterium tumefaciens and Arabidopsis plants were then transformed. T1 and T2 plant generations were obtained. Total plant proteins were extracted from T2 leaves; the Bradford assay was used to determine protein concentrations. A nickel-coated ELISA plate method, using both anti-His and anti-IpaC 1 degrees antibodies, was used to detect and quantify IpaC in transgenic Arabidopsis plants. Between 1.9 and 2.3 microg IpaC/mg total plant protein was obtained; this equals 0.2% of total protein, an amount comparable to other recombinant protein estimates in plants. Expressing His-tagged proteins from bacterial pathogens, in plants, is important because plant material could ultimately be fed or applied intranasally to animals that are "at risk" for infection by such bacterial pathogens, thus causing them to raise antibodies against the pathogens--functioning as a vaccine.     

拟南芥根特异表达基因启动子在烟草中的表达

以拟南芥为材料,利用PCR技术分离pyk10启动子序列,构建了该启动子GUS植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,分析该基因在烟草中的表达,以明确拟南芥根特异表达基因pyk10启动子在烟草中的表达特性.结果表明:克隆的pyk10启动子与已报道的pyk10启动子一致性为100%,GUS基因在烟草的根部特异表达,表明该启动子为根部特异表达启动子,为揭示植物根的发生、分化和发育机制,以及培育抗根部病虫害和营养高效利用型转基因烟草奠定了基础.     

Phytosterols play a key role in plant innate immunity against bacterial pathogens by regulating nutrient efflux into the apoplast

Bacterial pathogens colonize a host plant by growing between the cells by utilizing the nutrients present in apoplastic space. While successful pathogens manipulate the plant cell membrane to retrieve more nutrients from the cell, the counteracting plant defense mechanism against nonhost pathogens to restrict the nutrient efflux into the apoplast is not clear. To identify the genes involved in nonhost resistance against bacterial pathogens, we developed a virus-induced gene-silencing-based fast-forward genetics screen in Nicotiana benthamiana. Silencing of N. benthamiana SQUALENE SYNTHASE, a key gene in phytosterol biosynthesis, not only compromised nonhost resistance to few pathovars of Pseudomonas syringae and Xanthomonas campestris, but also enhanced the growth of the host pathogen P. syringae pv tabaci by increasing nutrient efflux into the apoplast. An Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) sterol methyltransferase mutant (sterol methyltransferase2) involved in sterol biosynthesis also compromised plant innate immunity against bacterial pathogens. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP710A1, which encodes C22-sterol desaturase that converts β-sitosterol to stigmasterol, was dramatically induced upon inoculation with nonhost pathogens. An Arabidopsis Atcyp710A1 null mutant compromised both nonhost and basal resistance while overexpressors of AtCYP710A1 enhanced resistance to host pathogens. Our data implicate the involvement of sterols in plant innate immunity against bacterial infections by regulating nutrient efflux into the apoplast.