载铜蒙脱石的抗菌机理研究

研究载铜蒙脱石对副溶血弧菌的抗菌效果和机理。载铜蒙脱石对副溶血弧菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度分别为75mg/L和300mg/L,而蒙脱石未显抗菌活性。细菌胞内酶活性结果显示,载铜蒙脱石可使细菌细胞膜发生损伤或通透性增大,导致细菌胞内酶的外漏。载铜蒙脱石对细菌呼吸代谢影响的结果表明,载铜蒙脱石可抑制三羧酸循环途径。原子力显微镜动态观察载铜蒙脱石作用下副溶血弧菌形态变化的结果发现,载铜蒙脱石能破坏细菌细胞膜。     

来自穿膜肽的新肽的抗菌活性及抑菌机制

[目的]研究基于穿膜肽和抗菌肽构效关系改造获得的新肽P7的抗菌活性及其对大肠杆菌(E.coli)的抑菌机制.[方法]微量稀释法和溶血实验分析P7的抑菌活性及其对正常细胞的细胞毒性;采用膜荧光探针、流式细胞术和扫描电镜分析P7对E.coli膜通透性、膜完整性的影响和细胞超微结构变化;通过激光共聚焦分析P7在E.coli细胞中的定位;凝胶阻滞实验测定P7与E.coli基因组DNA结合能力.[结果]P7比母肽显示更强的抑菌活性,最低抑菌浓度范围为4-32 μmol/L,且在作用浓度范围内具有较弱的溶血活性.P7可以增加E.coli外膜和内膜的通透性,使E.coli细胞膜的完整性和细胞表面结构受损.同时P7可以穿过E.coli细胞膜在细胞质聚集并与基因组DNA结合.[结论]P7通过增加E.coli内外膜通透性,穿过细胞膜与胞内DNA结合发挥抑菌活性.     

超高压处理对副溶血性弧菌细胞膜组成成分的影响

【目的】探讨水产品中副溶血性弧菌基于细胞膜损伤和修复的耐超高压胁迫机制。【方法】以80-250MPa超高压多次处理原始敏感菌株,从中筛选分离副溶血弧菌的耐压菌株,通过紫外分光光度法测定超高压处理前后细胞膜通透性的变化;采用SDS-PAGE电泳技术分析原始敏感菌株与耐高压胁迫菌株细胞膜可溶性蛋白的差异,采用超微量Na+K+ATP酶试剂盒分别测定原始菌株与耐压菌株的Na+K+ATP酶活性,用GC-MS法分析耐压菌株与原始菌株细胞膜脂肪酸组成的差异。【结果】分离获得的副溶血弧菌耐压菌株直接经250 MPa压力胁迫处理,存活量可较原始菌株提高103数量级。当处理压力大于400 MPa时,耐压菌株上清液中核酸物质泄露与原始菌株差异显著。耐压菌的可溶性膜蛋白在分子量为36 kDa处浓度明显增加,Na+K+ATPase酶活性比原始菌株提高了83.3%,细胞膜不饱和脂肪酸含量由51.57%变为54.23%。【结论】原始的副溶血性弧菌在250 MPa压力处理后存活率为0.0008%,而耐高压胁迫菌株在250 MPa压力处理后存活率可达到0.28%。经超高压处理分离得到的耐压菌株细胞膜上低分子量可溶性膜蛋白含量高于原始菌株、Na+K+ATPase酶活性显著高于原始菌株、不饱和脂肪酸比例加大,这些细胞膜上的主要成分含量的变化均与菌株耐压性有关。     

贝莱斯芽孢杆菌Y6抗菌肽抑制白念珠菌活性的研究CSCD

目的对贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物抑制白念珠菌活性及其作用机理进行初步研究。方法采用平板结合牛津杯研究贝莱斯芽孢杆菌Y6发酵上清液对白念珠菌抑制活性,梯度稀释法测定了最小抑菌浓度(MIC),通过薄层色谱法对代谢物的活性成分进行筛检;同时比较抗菌肽处理前和处理后菌体胞内大分子释放量及荧光染料PI的摄入量的变化,考察抗菌肽对胞膜通透性影响。结果贝莱斯芽孢杆菌Y6代谢物能有效抑制白念珠菌生长繁殖,测试浓度为10 mg·mL^(-1)时,抑菌圈直径达到(38.2±0.5)mm,其MIC浓度为0.625 mg·mL^(-1);通过薄层色谱结合茚三酮显色对活性组分筛检发现Y6代谢物中有2个抗菌组分,其中主要活性组分遇茚三酮显紫色,推测为肽类组分;经抗菌肽处理后的白念珠菌胞内大分子释放量及PI摄入量明显高于对照组,表明菌株Y6抗菌肽对白念珠菌胞膜完整性具有一定的损伤作用。结论贝莱斯芽孢杆菌Y6产肽类抗菌物质,且对白念珠菌细胞膜存在一定的损伤作用,从而产生明显的抗菌活性。     

抗副溶血弧菌海洋真菌HL-3菌株的鉴定及其活性物质的分离

【背景】目前水产养殖中副溶血弧菌等水产致病菌的预防和治疗主要使用的是抗生素,短期内能够起到较好的效果,但是长期使用抗生素不仅使得病原菌的耐药性增加,而且会产生一系列问题。因此,寻找安全有效的抗生素替代品迫在眉睫。【目的】筛选具有抗副溶血弧菌活性的海洋微生物,鉴定其种类并优化其培养条件,并对其活性物质进行初步分离。【方法】利用稀释涂布平板法和平板划线法分离纯化海洋微生物,通过牛津杯法筛选具有抗副溶血弧菌活性的菌株。根据菌株的形态特征和ITS序列分析对活性菌株进行鉴定。通过筛选培养基种类和盐度确定其培养条件。通过半制备高效液相色谱制备化合物,并利用核磁共振波谱数据鉴定化合物的结构。【结果】从海螺、小黄鱼、对虾等11种样品中分离出海洋微生物菌株76株,其中真菌26株。筛选得到一株具有抗副溶血弧菌活性的真菌菌株HL-3,鉴定为黄曲霉。黄曲霉HL-3菌株在改良沙氏培养基条件下,产物化学多样性和抗菌活性较好。黄曲霉HL-3菌株在真菌5号培养基中产物单一且抗菌活性较好,纯化出来的化合物结构被鉴定为曲酸。曲酸对副溶血弧菌的最小抑菌浓度为4.0mg/mL。【结论】实验结果为进一步利用各种色谱手段分离纯化...     

复合诱变选育绿色产色链霉菌抑菌高活性菌株

以一株绿色产色链霉菌xzte06菌株为出发菌株,依次通过软X射线、低能离子束诱变、紫外线照射和微波诱变手段对菌株进行复合诱变,得到一株对产气荚膜梭状芽胞杆菌具有较强抑制活性的菌株W26菌株,且该菌株的遗传特性稳定。对菌株进行抑菌试验发现,该菌株液体深层发酵菌丝体的内酮提取物的抑菌活性与出发菌株相比提高了101.42%。     

短小芽胞杆菌HLK8-1的分离鉴定及抑菌特性分析

从海南翁田镇凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)养殖场筛选获得1株能抑制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等多种病原菌的芽胞杆菌HLK8-1。经形态特征分析、16S r DNA序列分析及Biolog微生物自动鉴定系统鉴定为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus);菌株生长及抑菌性能研究表明该菌株抑菌物质主要产生在生长对数期及平台期;相对于盐度及初始p H等因素,该菌株的抑菌性能受温度影响较大;菌株在p H值范围为7.0~8.5,盐度范围为0~0.2%,温度为30℃等条件下表现出较高的生长水平及抑菌性能;共培养试验表明该菌能将水体中的副溶血弧菌数量控制在较低水平,培养24 h时实验组105cfu/m L,而对照组108cfu/m L。该菌抑制多种水产病原菌,对水体环境耐受能力强,具有防治水产养殖病原菌的应用潜力,且易于培养,抑菌物质分泌到胞外便于分离提取,亦具有发酵工程应用潜力。     

副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统vscG基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性病原微生物,Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretionSystem,T3SS)在致病过程中发挥重要作用。vscG基因编码的Vsc G蛋白是Ⅲ型分泌系统的伴侣蛋白。vscG基因在副溶血弧菌中的生物学功能尚未确定。【目的】构建副溶血弧菌vscG基因的缺失株和回补株,研究vscG基因对副溶血弧菌生物学特性的影响。【方法】在副溶血弧菌POR-1菌株基础上利用同源重组法构建vscG基因的缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG,分析比较POR-1、ΔvscG和CΔvscG在生长性能、生物被膜形成能力、运动性、溶血活性、细胞黏附和细胞毒性等方面存在的差异。【结果】与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG的生长特性和溶血活性无明显差异,缺失株ΔvscG的生物被膜形成能力下降,运动性较POR-1菌株和回补株CΔvscG增强。细胞感染试验显示,vscG基因的缺失明显降低了副溶血弧菌对HeLa细胞的黏附和毒性作用。【结论】vscG基因影响副溶血弧菌生物被膜的形成和运动性,在该菌黏附细胞和发挥细胞毒性过程中具有重要作用,为进一步探讨副溶血弧菌T3SS的致病机理奠定基础。     

新疆家蚕抗菌肽抗菌作用的超微结构观察及抗菌机理初探

为探讨基因工程表达的新疆家蚕(Bombyx mori)抗菌肽(cecropin-XJ)的抗菌机制,通过紫外分光光度法研究抗菌肽的抑菌动力学,并采用透射电镜观察抗菌肽作用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)后的超微结构,对抗菌肽抗菌机理进行初步探讨。结果表明,抗菌肽抑菌作用比较明显,抗菌肽的活性与作用时间有关。抗菌肽可能是通过"桶-板"模式渗透细胞膜,从而影响细胞膜的结构和功能,使细胞膜形成许多孔道,增强了金黄色葡萄球菌细胞的通透性,造成细胞内的原生质扩散,并从孔道向胞外渗漏,影响了细菌的代谢系统,从而起到抑菌、杀菌作用。抗菌肽使金黄色葡萄球菌细胞内容物大量渗漏而死亡,死亡细胞的细胞壁保持完整,表明细胞膜是抗菌肽作用的主要靶位点。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB, 常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种, 弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98%, 相互间不能区分; HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98%以上, 而与所有其它弧菌的相似性不到92%。结合表型和分子特征的鉴定结果, 菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

溶藻弧菌的毒力相关基因及其对小鼠的致病力

【目的】通过多重PCR检测和小鼠动物实验,对溶藻弧菌环境分离株的毒力因子进行评估,以期获得较强致病菌株和弱致病菌株之间的差别,并初步探讨该菌毒力因子对小鼠的致病机理。【方法】采用多重PCR体系检测毒力相关基因,我妻氏血平板溶血实验和平板酶活实验检测溶藻弧菌株的溶血素和胞外酶;以昆明小白鼠为实验动物,攻毒方式为灌胃和腹腔注射,根据小鼠的致病症状和死亡情况来分析和对比溶藻弧菌的胞外分泌物以及菌体本身的毒性。【结果】10株溶藻弧菌产淀粉酶、卵磷脂酶的比例为100%,脂肪酶、明胶酶次之(为70%),脲酶均未被检出;神奈川现象阳性菌株率为60%。毒力基因检测的结果显示10株溶藻弧菌中toxR、Collagenase、tlh、FlaA、ompW、AspA、fur这些与毒力有关的基因均有分布,而toxS、trh、tdh、UreR并未检出。10株溶藻弧菌中的VA009对小鼠显示了较强的致病性,能造成腹腔积液,经腹腔注射感染此菌后7 d内死亡率高达80%。【结论】不同的溶藻弧菌对小鼠的致病性存在较大差异,溶藻弧菌菌体本身比胞外分泌物对其毒性的贡献要大,而副溶血弧菌的毒性则由其胞外分泌物起主要作用;比较我们筛选出的强致病菌株与弱致病菌株,其上述毒力基因的分布并没有差别,说明溶藻弧菌可能存在一套与副溶血弧菌不同的独立的毒力基因系统。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌（Vibrioatginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98％,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98％以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92％。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

VHH/TLH溶血素基因在海洋弧菌中分布的研究

哈维氏弧菌(V.harveyi)的VHH溶血素是对海水养殖鱼类的潜在致病因子。哈维氏弧菌的VHH溶血素基因与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的TLH热不稳定性溶血素基因具有高度相似性,其氨基酸序列的相似性达到85.6 %。根据哈维氏弧菌vhhA溶血素基因序列,合成一个地高辛标记的VHH基因探针,利用其进行Southern Blot ,检测VHH溶血素基因在57株弧菌(包括26株国际标准菌株,20株哈维氏弧菌,11株副溶血弧菌)中的分布情况。结果显示,VHH基因探针与13株弧菌标准菌株有强杂交信号,包括2株溶藻胶弧菌(V.alginolyticus) ,2株哈维氏弧菌以及1株霍氏格里蒙菌(Grimontia hollisae) ,坎贝氏弧菌(V.campbellii) ,辛辛那提弧菌(V.cincinatiensis) ,费氏弧菌(V.fischeri) ,拟态弧菌(V.mimicus) ,飘浮弧菌(V.natriegens) ,副溶血弧菌,解蛋白弧菌(V.proteolyticus)和火神弧菌(V.logei)。与6株弧菌标准菌株有弱杂交信号,包括鳗弧菌(V.anguillarum) ,河口弧菌(V.aestuarianus) ,美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp.damselae) ,河弧菌(V.fluvialis) ,弗尼斯弧菌(V.furnissii)和创伤弧菌(V.vulnificus) ,而另外7株弧菌标准菌株中无杂交信号。所有的哈维氏弧菌菌株至少含有一条杂交带,其中菌株VIB645 , VIB 648和SF-1分别含有2条杂交带。11株副溶血弧菌中均含有一条杂交带。上述数据表明,vhh/tlh溶血素基因广泛分布于弧菌中,尤其是哈维氏弧菌相关菌株和费氏弧菌相关菌株中。另外对鳗弧菌VIB 72 ,坎贝氏弧菌VIB 285 ,飘浮弧菌VIB 299和哈维氏弧菌VIB 647的vhh/tlh溶血素基因进行克隆并测序,其氨基酸序列与VHH溶血素和TLH溶血素氨基酸序列的同源性分别为67 %~99 %和69 %~91 %。对vhh/tlh溶血素基因在弧菌中的分布研究,将有助于进一步确定这类溶血素基因在病原弧菌致病性中的作用。     

多重实时PCR检测产毒素性霍乱弧菌和副溶血弧菌

设计引物和探针,优化多重实时PCR条件,以同时检测霍乱弧菌霍乱毒素基因ctxA、副溶血弧菌种特异性基因gyrB和耐热肠毒素基因tdh。该多重实时PCR方法检测产毒素性的O1群(3株)和O139群(44株)霍乱弧菌菌株、不产毒素的O1群(12株)和O139群(6株)及非O1非O139群(7株)霍乱弧菌菌株的ctxA,阳性和阴性结果与普通PCR检测结果100%符合;检测副溶血弧菌种特异性gyrB,116株副溶血弧菌均阳性,而9株其它细菌和72株霍乱弧菌均阴性;检测tdh的阳性和阴性结果也与普通PCR结果完全一致。另外还建立了检测副溶血弧菌菌株trh1和trh2的单重实时PCR方法。     

原生质体紫外诱变选育高产抗菌脂肽菌株及其活性物质的研究

本研究以实验室自主分离的枯草芽孢杆菌mutHS-301为出发菌株,通过原生质体紫外诱变选育出高产抗菌脂肽突变菌株,并对其产生的抗菌脂肽提取物进行单组分分离纯化及对黄曲霉抑制作用进行初步研究。结果表明,在溶菌酶浓度为0.5 mg/mL,酶解时间为15 min,酶解温度为37℃条件下,获得原生质体的形成率和再生率效果最佳。采用紫外照射时间60 s进行该原生质体诱变,经筛选获得一株遗传性状稳定的高产抗菌脂肽菌株,命名为mutHS-539。研究表明,该突变株mutHS-539发酵上清液对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径较原始菌mutHS-301分别提高了21.49%和21.05%,提取得到的抗菌脂肽产量较原始菌提高了40%。利用制备型硅胶板对发酵提取物进行分离纯化得到四种组分,分别为a、b、c和d;进一步检测对黄曲霉的抑菌活性,结果发现只有组分d对黄曲霉具有显著的抑制作用。经RP-HPLC分析及液质联用数据比对,该组分d的主要成分为杆菌霉素D。该抗菌脂肽提取物对黄曲霉抑制作用的研究显示,当抗菌脂肽浓度为0.2 mg/mL时能有效抑制黄曲霉菌丝的生长,抑制率达到了74.22%,且对黄曲霉孢子的致死浓度为0.8 mg/mL。     

枯草芽孢杆菌中bacilosarcin B对美人鱼发光杆菌的抑菌机理

【背景】美人鱼发光杆菌(Photobacteriumdamselae)是一种海洋条件致病菌,能够引起多种海洋生物和人类疾病。因此,探究美人鱼发光杆菌的生物防治技术具有重要意义。【目的】探究枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中bacilosarcin B对美人鱼发光杆菌的抑菌活性及其可能的抑菌机理。【方法】利用高效液相色谱法从枯草芽孢杆菌fmb60发酵液中制备bacilosarcin B,采用分光光度法测定bacilosarcinB对多种致病菌的最小抑菌浓度及其对美人鱼发光杆菌的时间-抑菌曲线。测定bacilosarcin B对美人鱼发光杆菌生物被膜、胞外核酸、蛋白质和胞内碱性磷酸酶含量的影响,结合荧光显微镜、扫描电镜和透射电镜检测美人鱼发光杆菌细胞膜通透性和细胞壁完整性,并研究bacilosarcin B对细菌运动能力和胞内DNA的作用。【结果】Bacilosarcin B对美人鱼发光杆菌最小抑菌浓度为8μg/mL。抑菌机理研究表明bacilosarcin B通过破坏细菌细胞壁和细胞膜的完整性使细胞膜通透性增强,造成细胞内成分渗出。此外,bacilosarcinB还可与...     

4株羊瘤胃功能性细菌的筛选

通过DNS法测定羊瘤胃源功能性细菌产生的纤维素酶和淀粉酶的活力,福林酚法测定产生的蛋白酶的活力,检测细菌产生酶的特性。同时检测菌株的发酵液对大肠埃希菌(ATCC25922)、副溶血弧菌(ATCC17802)、藤黄八叠球菌(HY78)和产气杆菌(AS1489)等指示菌的抑制能力,分析它们的抑菌活性。结果表明,羊瘤胃源细菌C13产生的纤维素酶活力最高,产酶量也最高;而细菌C5产淀粉酶活力和蛋白酶活力最高,产生淀粉酶和蛋白酶的能力也最高。抑菌活性检测发现,细菌C9对副溶血弧菌(ATCC17802)有很高的抑制作用,而细菌C12对大肠埃希菌(ATCC25922)的抑制能力最明显。     

溶藻弧菌溶血活性检测及溶血素基因、启动子区功能

[目的]研究溶藻弧菌的溶血现象,溶血素基因vah的分布及vah基因、vah启动子区对溶藻弧菌溶血活性的贡献.[方法]对46株分离自华南沿海水生动物体内和海水的溶藻弧菌环境株及溶藻弧菌标准株1.1587进行溶血实验;比较具有溶血活性的溶藻弧菌野生株ZJ051、vah基因大肠杆菌BL21重组表达株、vah缺失突变株和基因回补株间溶血能力的差异;检测vah基因在溶藻弧菌中的分布,比较溶血株与非溶血株vah基因及上游启动子区的序列差异.[结果]47.8％的溶藻弧菌菌株产生溶血活性,因此溶血现象普遍存在于溶藻弧菌环境株中;vah基因的表达产物具有溶血活性,vah基因缺失突变株不具有溶血活性,而vah基因回补株恢复溶血活性.vah基因普遍存在于溶藻弧菌中,且基因序列非常相似,氨基酸序列完全相同,然而不同菌株的启动子区第188-190碱基位点存在差异.[结论]溶藻弧菌vah基因是造成溶藻弧菌溶血的直接原因,但溶藻弧菌溶血能力的差异并非是由vah基因本身差异决定,极有可能与启动子区第188-190碱基位点相关.     

抗菌肽作用机制的研究进展

抗菌肽是一类来源于多种生物、能有效杀灭病原体的小分子多肽,具有活性谱广、作用强且迅速、不易产生耐药等众多优点.作为新一代抗感染候选药物,抗菌肽的作用机制还未完全清楚,但目前有两种观点已得到公认,即胞膜渗透作用破坏胞膜结构完整性和作用于胞内不同靶点干扰细菌生长及代谢平衡.本文主要就抗菌肽理化性质、二级结构、作用机制以及后两者间的关系做一总结,以便更好的理解抗菌肽的构效关系,为合理设计抗菌肽提供理论基础.     

一株有抑菌活性海洋放线菌的筛选及鉴定

目的:筛选具有抑菌活性的海洋放线菌.方法:以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母、黑曲霉、苏云金芽孢杆菌、副溶血弧菌、胶质芽孢杆菌作为指示菌,采用滤纸片法进行筛选,将筛选到的菌株进行培养特征研究、生理生化试验及16S rDNA序列分析,并将测序结果提交至NCBI进行相似性检索,进而绘制出系统进化树,得到鉴定结果.结果:从舟山海域分离到1株具有较好抑菌活性的放线菌菌株a10,鉴定结果显示a10是一株浅玫瑰色链霉菌突变株.