性早熟雌性Sprague-Dawle大鼠下丘脑Lin28a和Lin28b表达异常

目的:研究正常雌性Sprague-Dawle(SD)大鼠不同性发育阶段及雌激素诱导性早熟后下丘脑Lin28a和Lin28b的表达及意义。方法:1)于雌性SD大鼠出生后15日(postnatal day 15,PND15)、PND23、PND35荧光实时定量PCR分析下丘脑Lin28a和Lin28b mRNA的表达,同时以ELISA法检测血清黄体生成素(LH)和雌二醇(E2)水平变化;2)苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate,EB)诱导的性早熟大鼠随机分为EB-1组和EB-2组,分别于阴道开口(vaginal opening,VO)时及PND56两个时间点处死,相应的发育阶段的大鼠用无菌芝麻油(sesame oil,OIL)作为对照分为OIL-1和OIL-2组;荧光实时定量PCR分析下丘脑Lin28a和Lin28b mRNA的表达,ELISA法检测LH和E2水平变化,并观察性早熟对大鼠阴道开口、体重、顶臀径、胫骨长等生长发育指标的影响。结果:1)PND15、PND23和PND35组下丘脑Lin28a和Lin28b mRNA表达、血清LH和E2水平无统计学差异(P0.05);2)EB-1组下丘脑Lin28a和Lin28b mRNA表达高于OIL-1组(P0.05),血清LH和E2水平与OIL-1组相比无统计学差异(P0.05);EB-2组下丘脑Lin28a和Lin28b mRNA表达高于OIL-2组(P0.05),血清LH和E2水平低于OIL-2组(P0.05);3)与OIL-2组比较,EB-2组VO时间明显提前(P0.01),体重、顶臀长、胫骨长差异无统计学差异(P0.05)。结论:外源性雌激素引起的性早熟可能导致下丘脑Lin28a和Lin28b表达异常。     

过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响

研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族miRNA表达水平和活性的影响。首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b。然后,以pAAV2neo-Gluc-(Fluc)为基本骨架,构建并获得检测let-7家族miRNA活性的8种质粒型载体,并包装为相应的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV),作为检测miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的传感器,命名为Asensor。在此基础上,以HeLaS3细胞为对照,用Western blot检测HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中Lin28a和Lin28b表达水平,用QRT-PCR测定let-7家族各成员表达水平,用Asensor检测let-7家族各成员活性。Western blot结果显示,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b均能有效地表达Lin28a和Lin28b蛋白;QRT-PCR检测结果显示,相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞中let-7家族各成员表达水平都下降(除let-7e外),但不同成员下降幅度存在差异;Asensor检测结果显示,let-7家族所有成员活性水平都下降,但不同成员下降幅度也存在差异,且同一成员活性水平与表达水平及其下降趋势也不一致。相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中let-7家族成员的表达和活性水平均明显下降,但表达水平的下降幅度比HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞大,而活性的下降幅度却与之相近。本研究建立了一种检测和比较miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的方法,首次研究了过表达Lin28a和Lin28b对细胞中的let-7家族miRNA活性影响,并发现Lin28a和Lin28b对let-7家族miRNA表达水平的影响和对其相应活性的影响不一致性,说明在检测miRNA表达水平的同时检测miRNA活性能更全面揭示miRNA的调节功能,为进一步研究let-7家族的调控机制奠定了基础。     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法。方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点（NcoⅠ及XhoⅠ）引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上。对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a（+）载体相连接并转化Rosetta（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析。结果对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA（NM₁45833）相比同源性为99.37%,与参照氨基酸序列相比同源性为100%;在IPTG诱导下pET-30a（+）-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质。结论利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础。     

转基因小鼠过表达人Lin28A/Lin28B对小鼠体重的影响

目的:Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白,对生物体的生命活动具有重要的调节作用.为了研究人Lin28A与Lin28B基因的功能,我们构建了分别过表达人Lin28A或Lin28B基因的两种转基因小鼠,表型分析发现小鼠体重变化,为研究Lin28A和Lin28B基因的生物学功能提供模型动物.方法:分别将人类Lin28A与Lin28B cDNA插入PCAG启动子下游,构建Lin28A与Lin28B转基因表达载体,通过显微注射方法,分别建立Lin28A转基因小鼠与Lin28B转基因小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型,筛选出人类Lin28A与Lin28B表达的小鼠,统计两种转基因小鼠体重变化.结果:①经PCR鉴定与公司测序证明Lin28A和Lin28B两种载体构建成功.②PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以特异性表达人Lin28A或Lin28B的转基因小鼠,并比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现两种转基因小鼠体重均大于同窝野生型小鼠,说明在小鼠体内过表达Lin28A或Lin28B均能引起小鼠体重增加.结论:人Lin28A与Lin28B在转基因小鼠体内能正常表达,并且能发挥生物学功能.又因为Lin28A和Lin28B在小鼠体内过表达会引起小鼠体重增加,我们推测其可能通过影响小鼠糖代谢过程引起小鼠体重改变.构建的Lin28A和Lin28B的转基因小鼠为进一步研究Lin28A和Lin28B在人新陈代谢、生长和发育过程中的作用提供了动物模型.     

Lin28A促进结肠癌细胞对5-FU 化疗敏感性的实验研究

目的:探讨Lin28A对结肠癌5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及其分子机制。方法:免疫组化方法检测人结肠癌和正常粘膜组织中Lin28A蛋白表达情况;荧光素酶法检测HCT116细胞活性;实时荧光定量PCR方法检测HCT116细胞中Let-7表达水平。结果:73.3%人结肠癌患者Lin28A蛋白表达上调;过表达Lin28A组与对照组相比,5-FU处理后细胞活性显著降低(P_(60μg)0.01,P_(80μg)0.01),Let-7表达显著降低;过表达Let-7组与对照组相比,5-FU治疗后细胞活性显著降低(P_(40μg)0.05,P_(60μg)0.01,P_(80μg)0.01)。结论:Lin28A可增强肿瘤细胞化疗敏感性,而且这一效应不依赖Let-7。     

长期运动对幼龄大鼠下丘脑脑源性神经营养因子表达的影响

目的：探讨下丘脑脑源性神经营养因子（BDNF）与幼龄大鼠长期运动中摄食调节活动的关系。方法：3周龄断乳SD大鼠随机分为运动组（E）和对照组（C）,运动组进行9周的游泳运动（每天1次,每周6 d）,运动时间由开始每次30 min逐渐增加到每次90 min。12周龄时用ELISA法测试血清BDNF含量,RT-PCR和Western blot方法检测下丘脑中BDNF mRNA、pro-BDNF和BDFN蛋白表达水平。结果：与C组比较,E组大鼠在运动第1周、第9周以及整个实验期间摄食量无变化。12周龄时与C组相比,E组血清BDNF含量和下丘脑BDNF mRNA表达水平无变化,但下丘脑pro-BDNF和BDNF蛋白表达水平升高（P〈0.05）。结论：长期运动使幼龄大鼠下丘脑BDNF和pro-BDNF蛋白表达水平同时升高。     

GnRH—a对大鼠海马和皮质部位parvalbumin表达的影响

目的：研究促性腺激素释放激素类似物（gonadotropin releasing hormone analogue,GnRH-a）对大鼠海马、皮质部位小白蛋白（parvalbumin,PV）表达的影响。方法：采用酶联免疫吸附试验测定血清激素水平,免疫组织化学和图像分析观察大鼠海马、皮质部位PV的表达。结果：①GnRH-a组大鼠血清雌二醇（estradiol,E2）、LH及FSH水平较正常对照组下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;与OVX组比较LH、FSH较低,差异有统计学意义（P〈0.05）,但E2差异不显著。②正常情况下,大鼠海马、皮质部位可观察到PV神经元及纤维分布。③GnRH-a组PV细胞数及灰度值低于正常对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）,与去卵巢组大鼠组相似;GnRH-a＋E2联合用药后,PV细胞数及灰度值与正常对照组相似。结论：GnRH-a降低大鼠海马、皮质部位神经元中PV的表达,从而影响神经元的功能,这可能与其用药后神经精神副反应有一定关系。     

人羊膜上皮干细胞联合富血小板血浆对宫腔粘连大鼠纤维化因子、炎症因子的作用

摘要 目的：探究人羊膜上皮干细胞（hAECs）联合富血小板血浆（PRP）对宫腔粘连大鼠的治疗效果,为临床中优化宫腔粘连治疗方法理论基础。方法：选用SPF级雌性SD大鼠共40只,依照随机数字表法随机分为空白组（A组）、假手术组（B组）、hAECs组（C组）、PRP组（D组）、hAECs+PRP组（E组）,每组各8只。A组不做任何处理,B组仅做麻醉、开关腹腔处理,C组、D组、E组使用搔刮法制备宫腔粘连模型。随后C组进行hAECs治疗,D组注射等量生理盐水。D组进行PRP治疗,C组注射等量生理盐水。E组进行hAECs联合PRP治疗。观察比较两组大鼠子宫内膜组织基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、盘状结构域受体2（DDR2）蛋白表达水平、PI3K/Akt/mTOR通路相关mRNA表达量、血清白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）水平以及各组大鼠妊娠孕囊数量比较。结果：与A组相比,B组的子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平、p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA水平以及血清IL-6、IL-8水平比较无差异（P＞0.05）;C组、D组、E组大鼠的子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平明显下降,IL-6、IL-8水平、p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达升高（P＜0.05）。其中,E组大鼠MMP-9、DDR2蛋白表达水平明显高于C组、D组,IL-6、IL-8水平及p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达低于C组、D组（P＜0.05）。C组、D组大鼠MMP-9、DDR2蛋白表达水平、血清IL-6、IL-8水平及p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达比较（P＞0.05）。妊娠孕囊数量方面,与A组比较,B组大鼠妊娠孕囊数量。结论：hAECs联合PRP治疗可能通过上调宫腔粘连大鼠子宫内膜组织MMP-9、DDR2蛋白表达水平并下调p-mTOR mRNA、p-Akt mRNA表达,同时降低炎性因子IL-6、IL-8水平,进而提高妊娠孕囊数量,起到治疗作用。     

运动干预对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌IL-1β表达的影响

目的观察运动干预对高脂饲料诱导胰岛素抵抗（IR）大鼠白细胞介素1β（IL-1β）表达的影响,探讨运动减轻IR的可能机制。方法健康Wistar雄性大鼠分为基础饲料喂养组（normal chow group,NC）,高脂膳食喂养组（high-fat diet group,HF）。高脂膳食喂养Wistar雄性大鼠10周,构建IR动物模型。10周后,HF组再随机分为高脂喂养运动组和非运动组,游泳运动干预4周。游泳运动干预前后以正常血糖-高血浆胰岛素钳夹实验技术[hyperinsulinemic-euglycemic clamp（HEC）technique]评估IR大鼠胰岛素敏感性,ELISA法测定大鼠血清IL-1β水平,RT-PCR法测定大鼠骨骼肌IL-1βmRNA表达。结果HF组大鼠葡萄糖输注率（glucose infusion rate,GIR）显著低于NC组（P〈0.05）,HF组血清IL-1β水平及骨骼肌组织IL-1βmRNA表达明显高于NC组（P〈0.05,P〈0.01）;运动组大鼠血清IL-1β水平及骨骼肌组织IL-1βmRNA表达明显低于非运动组（P〈0.05）,与NC组差异无显著性（P〉0.05）。结论运动改善IR大鼠胰岛素敏感性,可能与降低IR大鼠IL-1β的表达有关。     

自发性高血压大鼠心脏中ACE,AT1R,ACE2和MasR表达变化的研究

目的：通过观察血管紧张素转化酶（ACE）和血管紧张素转化酶2（ACE2）在Wistar-京都种大鼠（WKY）和自发性高血压（SHR）大鼠心脏组织中表达的差异,探讨ACE与ACE2在自发性高血压大鼠高血压形成中的作用。方法：自由饲喂14周龄WKY和SHR雄性大鼠一周后,用BSN-II多通道无创测压系统测定大鼠收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、心率（HR）并称重;放免法测定血浆中血管血管紧张素Ⅱ（AngII）含量;Real-time PCR测定心脏组织中ACE,ATI受体（ATIR）,ACE2和Mas受体（MasR）mRNA的表达水平;Western blot法检测心脏组织中ACE2的蛋白表达。结果：SHR大鼠SBP和DBP均显著高于WKY大鼠（P〈0.01）;两组大鼠心率和体重无显著差异（P〉0.05）;SHR大鼠血浆中AngII含量显著升高（P〈0.05）;与WKY大鼠相比,SHR大鼠心脏中ACE mRNA表达均显著升高（P〈0.05）,ACE2的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（P〈0.05）;心脏组织中AT1R和MasR的mRNA表达没有显著性变化（P〉0.05）。结论：ACE与ACE2表达失调是SHR大鼠高血压形成的主要原因之一,其机理可能与局部组织RAS系统ACE-AngII-AT1R通路过度活跃,ACE2-Ang（1-7）-MasR通路相对不足有关。     

Lin28 gene and mammalian puberty

Lin28a and Lin28b, homologs of the Caenorhabditis elegans Lin28 gene, play important roles in cell pluripotency, reprogramming, and tumorigenicity. Recently, genome‐wide association and transgenic studies showed that Lin28a and/or Lin28b gene were involved in the onset of mammalian puberty, the stage representing the attainment of reproduction capacity; however, the detailed mechanism of these genes in mammalian puberty remains largely unknown. The present paper reviews the research progress on the roles of Lin28a/b genes in the onset of mammalian puberty by analyzing the results coming from gene expression patterns, mutations, and transgenic studies, and put forward possible pathways for further studies on their roles in animal reproduction.     

关节腔注射联合周林频谱仪治疗对类风湿关节炎合并骨关节炎的体会

目的：探讨关节腔注射联合周林频谱仪对类风湿关节炎合并骨关节炎的疗效及护理体会。方法：将本院90例类风湿关节炎合并骨关节炎患者随机分成3组,所有患者治疗前均进行全身情况评估以及相应的常规护理措施．对照A组30例予以玻璃酸钠20mg关节腔内注射,观察A组30例使用玻璃酸钠关节腔内注射联合周林频谱仪患处照射,平均时间（19±4．5）min,照射距离以皮肤感觉温热为宜。观察B组30例在观察A组治疗方案基础上实施康复训练。三组均以15d为一疗程,疗程结束后比较各组患者临床总有效率、血液流变学变化情况以及不良反应的发生率。结果：（1）治疗后观察组临床症状总有效率较对照组比较具有统计学差异（P〈0．05）,观察组优于对照组,治疗后观察B组临床症状总有效率较观察A组比较具有统计学差异（P〈0．05）,观察B组优于观察A组;（2）治疗后三组血流速度（Vs）、平均血流速度（Vd）、舒张末期血流速度（Vm）均较治疗前升高（P〈0．05）,其中观察组升高幅度较对照组明显（P〈0．05）;观察组中观察B组优于观察A组（P〈0．05）;（3）三组不良反应发生率比较无统计学差异（P〉0．05）。结论：玻璃酸钠关节腔内注射联合周林频谱仪对类风湿关节炎合并骨关节炎疗效肯定,能快速改善患者临床症状,科学良好的康复护理干预是促进疗效的关键。     

Drosha mediates destabilization of Lin28 mRNA targets

Lin28 plays important roles in development, stem cell maintenance, oncogenesis and metabolism. As an RNA-binding protein, it blocks the biogenesis primarily of let-7 family miRNAs and also promotes translation of a cohort of mRNAs involved in cell growth, metabolism and pluripotency, likely through recognition of distinct sequence and structural motifs within mRNAs. Here, we show that one such motif, shared by multiple Lin28-responsive elements (LREs) present in Lin28 mRNA targets also participates in a Drosha-dependent regulation and may contribute to destabilization of its cognate mRNAs. We further show that the same mutations in the LREs known to abolish Lin28 binding and stimulation of translation also abrogate Drosha-dependent mRNA destabilization, and that this effect is independent of miRNAs, uncovering a previously unsuspected coupling between Drosha-dependent destabilization and Lin28-mediated regulation. Thus, Lin28-dependent stimulation of translation of target mRNAs may, in part, serve to compensate for their intrinsic instability, thereby ensuring optimal levels of expression of genes critical for cell viability, metabolism and pluripotency.     

Drosha mediates destabilization of Lin28 mRNA targets

Lin28 plays important roles in development, stem cell maintenance, oncogenesis and metabolism. As an RNA-binding protein, it blocks the biogenesis primarily of let-7 family miRNAs and also promotes translation of a cohort of mRNAs involved in cell growth, metabolism and pluripotency, likely through recognition of distinct sequence and structural motifs within mRNAs. Here, we show that one such motif, shared by multiple Lin28-responsive elements (LREs) present in Lin28 mRNA targets also participates in a Drosha-dependent regulation and may contribute to destabilization of its cognate mRNAs. We further show that the same mutations in the LREs known to abolish Lin28 binding and stimulation of translation also abrogate Drosha-dependent mRNA destabilization, and that this effect is independent of miRNAs, uncovering a previously unsuspected coupling between Drosha-dependent destabilization and Lin28-mediated regulation. Thus, Lin28-dependent stimulation of translation of target mRNAs may, in part, serve to compensate for their intrinsic instability, thereby ensuring optimal levels of expression of genes critical for cell viability, metabolism and pluripotency.     

Lin28a attenuates TGF-β-induced renal fibrosis

Lin28a has diverse functions including regulation of cancer, reprogramming and regeneration, but whether it promotes injury or is a protective reaction to renal injury is unknown. We studied how Lin28a acts in unilateral ureteral obstruction (UUO)-induced renal fibrosis following unilateral ureteral obstruction, in a mouse model. We further defined the role of Lin28a in transforming growth factor (TGF)-signaling pathways in renal fibrosis through in vitro study using human tubular epithelium-like HK-2 cells. In the mouse unilateral ureteral obstruction model, obstruction markedly decreased the expression of Lin28a, increased the expression of renal fibrotic markers such as type I collagen, α-SMA, vimentin and fibronectin. In TGF-β-stimulated HK-2 cells, the expression of Lin28a was reduced and the expression of renal fibrotic markers such as type I collagen, α-SMA, vimentin and fibronectin was increased. Adenovirus-mediated overexpression of Lin28a inhibited the expression of TGF-β-stimulated type I collagen, α-SMA, vimentin and fibronectin. Lin28a inhibited TGF-β-stimulated SMAD3 activity, via inhibition of SMAD3 phos-phorylation, but not the MAPK pathway ERK, JNK or p38. Lin28a attenuates renal fibrosis in obstructive nephropathy, making its mechanism a possible therapeutic target for chronic kidney disease.