橡胶树DELLA基因HbRGL1的克隆与表达分析

DELLA蛋白属于植物特异性GRAS家族,是植物生长的负调控因子。为揭示橡胶树DELLA基因在橡胶树生长发育中的分子调控机制,本研究从橡胶树热研7-33-97中克隆HbRGL1的cDNA全长序列,含1 851 bp的ORF,编码616个氨基酸。生物信息学分析表明HbRGL1属于不稳定的亲水蛋白,定位在细胞核上,含有DELLA和GRAS保守结构域。系统进化关系分析表明HbRGL1与橡胶树HbGAIL、木薯MeGAIL、蓖麻RcGAI、麻风树JcGAI聚为一类。qRT-PCR分析表明HbRGL1在橡胶树不同组织中的表达量差异显著,在花中的表达量最高。在生长素（IAA）、乙烯利（ET）和脱落酸（ABA）等不同激素处理叶片中HbRGL1表达量均呈现显著上调趋势,尤其对赤霉素（GA₃）的应答具有反应快速且上调表达倍数最高。本研究为进一步阐明HbRGL1在橡胶树生长发育中的功能奠定理论基础。     

R2R3型MYB转录因子HbMYB88结构和功能分析

R2R3-MYB转录因子参与植物生长发育、激素信号传导和逆境响应等生物过程。为了揭示橡胶树MYB家族成员结构与功能,从橡胶树热研73397（RY73397）叶片中克隆HbMYB88的cDNA全长。该基因长为1 848 bp,含1 440 bp的ORF,编码479个氨基酸。HbMYB88蛋白序列包含2个SANT保守结构域,存在HTH三级结构,与拟南芥AtMYB88、AtMYB124具有高度相似性。AtMYB88、AtMYB124与干旱等逆境相关且未划分亚族。qRT-PCR分析发现HbMYB88在橡胶树茎和花中表达量高,在根、叶片、树皮和胶乳中表达量极低。热研73397组培苗叶片喷施过氧化氢（H₂O₂）和脱落酸（ABA）等处理后,HbMYB88表达量受诱导显著上调表达。表明HbMYB88与橡胶树抗旱等逆境反应有关,为深入研究其结构和功能打下基础。     

棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4启动子的克隆及序列分析

棉纤维是纺织行业的重要原材料。赤霉素能够促进棉纤维的生长发育,而DELLA蛋白又是赤霉素信号转导通路中的关键调控因子,因此研究棉花DELLA蛋白基因表达的调控模式,对阐明棉纤维生长发育的分子生物学机理具有重要意义。本研究根据两个棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4序列设计特异引物,以陆地棉新陆早13号的基因组DNA为模板,用基因组步移法克隆了棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4的启动子。对两个启动子进行序列分析表明,这两个启动子均具有真核生物典型的核心启动子区,同时也都具有一个或多个光响应元件和赤霉素响应元件,说明这两个基因可能受到光信号和赤霉素信号的调控,这与其它植物中DELLA蛋白的表达模式是一致的。此外,这两个启动子还具有各种转录调控相关的顺式作用元件,比如其它激素类的响应元件和逆境胁迫响应元件,说明棉花中DELLA蛋白基因可能在响应其它激素信号以及逆境胁迫中也起到一定的作用。     

葡萄VvRGL基因应答GA调控无核果实发育的研究

DELLA蛋白是GA信号传导途径的核心作用元件,属于GRAS核转录调节因子家族。该研究以‘魏可’葡萄品种为试材,通过基因克隆、启动子分析、染色体定位、基因蛋白结构及系统进化分析,鉴定VvRGL1和VvRGL2精确序列,预测其潜在功能,并采用qRT-PCR技术检测VvRGL基因应答GA在果皮、果肉及种子(区)的时空表达特征。结果表明:(1)VvRGL1及VvRGL2的染色体定位为Chr14和Chr7,开放阅读框(ORF)为2 007bp和1 815bp,编码氨基酸数量为668和604个;二者均含有GRAS保守结构域,但却不具备DELLA结构域,属于GRAS转录因子大家族成员,而不属于DELLA亚家族;基因结构分析表明,VvRGL1的DNA序列有1个内含子,2个外显子,而VvRGL2的DNA序列无内含子,有1个外显子,基因结构高度保守;进化分析表明,VvRGL1与拟南芥和柑桔的亲缘关系较近,而VvRGL2与草莓和杨树的亲缘关系较近。(2)2个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和种子胚乳发育过程。(3)qRT-PCR结果显示,外源GA处理均不同程度降低了2个基因在葡萄果皮和种子区的表达,但却上调了其在幼果期果肉中的表达,表明在果皮与种子(区)中,GA可能通过抑制葡萄VvRGL1/RGL2基因的表达参与调控葡萄无核果实的发育。本研究结果为进一步阐明VvRGL在赤霉素信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制提供重要依据。     

巴西橡胶树HbNTL1基因启动子的克隆与序列分析

膜结合NAC转录因子(NTLs)是植物NAC转录因子家族中一类C端具有跨膜结构域(transmembrane motifs,TMs)的转录调控因子,在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中具有重要的功能。根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)膜结合类NAC转录因子HbNTL1基因cDNA序列,利用基因组步移的方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbNTL1基因上游1 718 bp的调控片段。序列分析表明,该段序列含有一个典型的真核生物核心启动子区域,转录起始位点A位于起始密码子上游206 bp处。该启动子序列除了含有多个TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外,还存在赤霉素、茉莉酸和脱落酸等激素响应元件以及大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如ABRE、DOFCOREZM、MYBCORE、W-box和MYCCONSENSUSATHSE等反应元件,表明HbNTL1转录因子可能是一个逆境胁迫相关NAC转录因子,在橡胶树抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要功能。     

橡胶树DELLA蛋白编码基因HbGAI的克隆与表达分析

该研究采用RT-PCR与RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因HbGAI(GenBank登录号为KT696439)。HbGAI全长cDNA序列2 050bp,包含1个长1 842bp的完整开放阅读框。序列分析显示,HbGAI基因编码613个氨基酸,其推导的蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为66.476kD,理论等电点为5.19,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白。进化树分析表明,HbGAI蛋白与其他植物中DELLA蛋白具有较高的相似性,与麻疯树JcGAI和蓖麻RcGAI亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,割胶和茉莉酸甲酯处理下调胶乳中HbGAI基因的表达,乙烯利处理4h内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达,表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、茉莉酸、乙烯响应中发挥作用。     

紫花苜蓿赤霉素受体基因的克隆及表达分析

赤霉素受体(GID)是赤霉素信号转导途径的重要成员,直接影响着赤霉素对植物体效应的发挥。该研究利用同源克隆的方法,首次从紫花苜蓿中克隆得到1个赤霉素受体基因,命名为MsGID1b。序列分析发现,MsGID1b基因开放阅读框长度为1 053bp,编码350个氨基酸,推测其蛋白质分子量为39.839kD,是一个无信号肽和跨膜结构的亲水性蛋白。序列比对结果表明,MsGID1b基因与蒺藜苜蓿MtGID1b基因的核苷酸序列相似性为98%,氨基酸序列相似性为99%,且具有HSL家族典型的HGG和GXSXG保守结构域及GA、DELLA蛋白结合位点。荧光定量PCR分析表明,MsGID1b基因在紫花苜蓿各组织中的表达丰度依次为:根盛花初花茎叶荚果;经GA3、ABA、NaCl、PEG和黑暗诱导后该基因表达上调,尤其是在GA3诱导下,MsGID1b基因的表达量一直维持在较高水平,表明MsGID1b基因可能参与紫花苜蓿的抗逆调控。     

巴西橡胶树HbMYB62转录因子基因的克隆和表达分析

R2R3-MYB类转录因子参与包括逆境胁迫反应等多种生物反应。为鉴定橡胶树中MYB转录因子的结构与功能,从橡胶树叶片中克隆HbMYB62全长的cDNA序列。该基因片段大小为1 013 bp,包含945 bp的ORF,编码314个氨基酸残基。其推导的氨基酸序列具有植物HTH_MYB的特异性结构域,并与拟南芥AtMYB62具有高度相似性。qRT-PCR发现HbMYB62主要在橡胶树花中表达,而在树皮、叶和乳胶中表达量较少。其叶片表达量在过氧化氢（H₂O₂）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）等处理下显著上调。表明HbMYB62与橡胶树的抗逆反应和激素信号传导过程有关,为进一步研究其结构和功能打下基础。     

橡胶树热激蛋白HbHSP90.8-1基因的克隆与功能分析

白粉病是橡胶树生长发育过程中主要叶部病害之一。热激蛋白90（HSP90）分子伴侣在植物逆境胁迫抗性中起着重要作用。为研究HSP90家族成员结构及其在橡胶树抗白粉病中的功能,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397叶片中克隆HbHSP90.8-1并采用生物信息学等技术对其结构和功能进行分析。结果表明,HbHSP90.8-1 cDNA序列全长2 844 bp,开放阅读框（ORF）2 454 bp,编码817个氨基酸。HbHSP90.8-1编码一个有信号肽、无跨膜结构且定位预测在内质网上的稳定亲水蛋白,存在HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域。系统进化分析结果表明橡胶树HbHSP90.8-1与木薯MeHSP90的亲缘关系最近,与麻风树JcHSP90聚为一类。通过qRT-PCR分析结果表明HbHSP90.8-1在橡胶树不同组织中均有表达,其在胶乳中的表达量最高;HbHSP90.8-1基因在白粉菌侵染、H₂O₂、ABA和ETH处理叶片中,表达量均呈现显著上调趋势;在MeJA和SA激素处理下,HbHSP90.8-1表达量呈现下调的趋势。说明HbHSP90.8-1参与橡胶树对白粉菌响应过程以及植物抗病相关激素信号转导途径。     

果树赤霉素代谢与信号途径研究进展

赤霉素作为5大植物激素之一,在果树的花芽分化、花序发育、开花坐果、果实的生长发育及植株的形态建成等方面扮演着重要的角色,但对果树赤霉素的分子生物学研究与其他大田作物相比差距较大。为了在果树生产中能更加合理有效地利用赤霉素调控果树花果发育,研究果树赤霉素的合成及其信号转导途径的分子调控机制十分必要。研究发现GA合成的关键酶KO、GA2ox及GA20ox的表达均与果树矮化呈负相关,而KS的含量则与植株高矮呈正相关,板栗雄性不育现象也与KO、KAO的表达量密切相关。GAMYB基因及LFY基因则在果树的成花诱导和雄蕊发育等生殖生长过程中发挥重要作用。DELLA蛋白在果树的GA信号途径中作为负调控因子可致使矮化植株形成,在果树的细胞周期循环过程、转录调控、花的形成、细胞的信号转导及许多生理过程中,DELLA蛋白泛素化降解均扮演着至关重要的角色。主要从果树赤霉素的合成及赤霉素的信号途径两大方面,着重对果树赤霉素合成过程中的关键酶基因及其定位、果树赤霉素信号途径的重要元件如赤霉素受体GID1、DELLA蛋白等进行了综述,以期为高效利用赤霉素调控果树生长发育提供重要的理论参考。     

Ethylene regulates arabidopsis development via the modulation of DELLA protein growth repressor function

Phytohormones regulate plant development via a poorly understood signal response network. Here, we show that the phytohormone ethylene regulates plant development at least in part via alteration of the properties of DELLA protein nuclear growth repressors, a family of proteins first identified as gibberellin (GA) signaling components. This conclusion is based on the following experimental observations. First, ethylene inhibited Arabidopsis root growth in a DELLA-dependent manner. Second, ethylene delayed the GA-induced disappearance of the DELLA protein repressor of ga1-3 from root cell nuclei via a constitutive triple response-dependent signaling pathway. Third, the ethylene-promoted "apical hook" structure of etiolated seedling hypocotyls was dependent on the relief of DELLA-mediated growth restraint. Ethylene, auxin, and GA responses now can be attributed to effects on DELLA function, suggesting that DELLA plays a key integrative role in the phytohormone signal response network.     

The suppressive function of the rice DELLA protein SLR1 is dependent on its transcriptional activation activity

When the gibberellin (GA) receptor GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF 1 (GID1) binds to GA, GID1 interacts with DELLA proteins, repressors of GA signaling. This interaction inhibits the suppressive function of DELLA protein and thereby activates the GA response. However, how DELLA proteins exert their suppressive function and how GID1s inhibit suppressive function of DELLA proteins is unclear. By yeast one-hybrid experiments and transient expression of the N-terminal region of rice DELLA protein (SLR1) in rice callus, we established that the N-terminal DELLA/TVHYNP motif of SLR1 possesses transactivation activity. When SLR1 proteins with various deletions were over-expressed in rice, the severity of dwarfism correlated with the transactivation activity observed in yeast, indicating that SLR1 suppresses plant growth through transactivation activity. This activity was suppressed by the GA-dependent GID1-SLR1 interaction, which may explain why GA responses are induced in the presence of GA. The C-terminal GRAS domain of SLR1 also exhibits a suppressive function on plant growth, possibly by directly or indirectly interacting with the promoter region of target genes. Our results indicate that the N-terminal region of SLR1 has two roles in GA signaling: interaction with GID1 and transactivation activity.     

巴西橡胶树一个AP2／EREBP转录因子的克隆及表达分析

本文采用RACE技术从巴西橡胶树中鉴定出一个AP2／EREBP转录因子。该转录因子全长cDNANl225bp,最长开放阅读框699bp,预测编码蛋白包含232个氨基酸;序列比对分析发现,该转录因子具有一段保守的AP2／EREBP结构域,与拟南芥Soloist（At4g13040）具有较高的相似性,将该基因命名HbSoloist。半定量胙PcR分析结果表明,HbSoloist在巴西橡胶树的胶乳、叶片、树皮和花中均有表达。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳HbSoloist表达量明显下降。研究发HbSoloist表达受乙烯利、茉莉酸和低温处理调控,表明HbSoloist基因可能在巴西橡胶树乙烯、茉莉酸和低温反应中发挥作用。     

非洲菊微管相关蛋白基因GMAP65-1功能分析

微管相关蛋白在植物生长发育过程中发挥重要作用。利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术对非洲菊(Gerbera hybrida)体内微管相关蛋白GMAP65-1基因进行了克隆, 获得的基因全长1 883 bp, 包含 1 740 bp的完整开放阅读框(ORF)。表达模式研究表明, 该基因在非洲菊幼嫩的根、叶及花中均有较高的表达, 且受到赤霉素(GA)诱导显著上调。构建GMAP65-1超表达载体, 经异源转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后筛选获得纯合株系, 对纯合株系进行表型观察。结果表明, GMAP65-1超表达植株的叶片及花瓣面积增大, 暗示该基因参与叶片及花瓣的形态建成。研究结果为花卉分子育种提供了理论依据及基因资源。     

Evidence that the Arabidopsis nuclear gibberellin signalling protein GAI is not destabilised by gibberellin

Plant growth is regulated by bioactive gibberellin (GA), although there is an unexplained diversity in the magnitude of the GA responses exhibited by different plant species. GA acts via a group of orthologous proteins known as the DELLA proteins. The Arabidopsis genome contains genes encoding five different DELLA proteins, the best known of which are GAI and RGA. The DELLA proteins are thought to act as repressors of GA-regulated processes, whilst GA is thought to act as a negative regulator of DELLA protein function. Recent experiments have shown that GA induces rapid disappearance of nuclear RGA, SLR1 and SLN1 (DELLA proteins from rice and barley), suggesting that GA signalling and degradation of DELLA proteins are coupled. However, RGL1, another Arabidopsis DELLA protein, does not disappear from the nucleus in response to GA treatment. Here, we present evidence suggesting that GAI, like RGL1, is stable in response to GA treatment, and show that transgenic Arabidopsis plants containing constructs that enable high-level expression of GAI exhibit a dwarf, GA non-responsive phenotype. Thus, GAI appears to be less affected by GA than RGA, SLR1 or SLN1. We also show that neither of the two putative nuclear localisation signals contained in DELLA proteins are individually necessary for nuclear localisation of GAI. The various DELLA proteins have different properties, and we suggest that this functional diversity may explain, at least in part, why plant species differ widely in their GA response magnitudes.