苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型多角体病毒AcMNPVP78／83蛋白初步研究

AcMNPV ORb-9编码病毒核衣壳蛋白P78／83,该蛋白在宿主细胞内以磷酸化和去磷酸化两种形式存在,能够与细胞骨架成分肌动蛋白相互作用,序列分析表明其具有与WASP蛋白类似的结构,推测可能在病毒粒子的包装、运输等过程中起重要作用。本文利用Bac—to-Bac系统构建了P78／83与绿色荧光蛋白融合表达的重组AcMNPV,激光共聚焦显微镜观察表明,重组病毒感染Sf21细胞12h后绿色荧光主要集中分布于细胞质中,24h及以后绿色荧光主要集中分布于细胞核中。感染试验表明,超表达P78／83对病毒的生长无明显的影响。     

肌动蛋白在AcMNPV向细胞外运输过程中作用的初步研究

本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒,即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP.用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞,以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照,用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况.由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的,所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况.实验中观察发现,AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光,在整个感染过程中是弥散分布的,而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24-72h这段时间内,肌动蛋白最初聚集在细胞核内,随后逐渐由细胞核向细胞质转移,最后完全聚集于细胞膜.根据实验结果,推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子(BV)由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程.     

肌动蛋白在AcMNPV向细胞外运输过程中作用的初步研究

本实验利用AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV)的bac-to-bac系统构建了两种重组病毒,即含GFP-actin融合基因的重组病毒AcMNPV-GFP-actin和含GFP基因的重组病毒AcMNPV-GFP。用这两种重组病毒分别感染Sf9细胞,以AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞为对照,用共聚焦激光扫描显微镜观察了绿色荧光在病毒感染过程中的分布情况。由于肌动蛋白和绿色荧光蛋白是共定位的,所以绿色荧光的分布情况就是肌动蛋白的分布情况。实验中观察发现,AcMNPV-GFP感染的Sf9细胞中的绿色荧光,在整个感染过程中是弥散分布的,而AcMNPV-GFP-actin感染Sf9细胞后24172h这段时间内,肌动蛋白最初聚集在细胞核内,随后逐渐由细胞核向细胞质转移,最后完全聚集于细胞膜。根据实验结果,推测肌动蛋白可能参与了AcMNPV出芽型病毒粒子(BV)由细胞核向细胞质运输以及从细胞膜排出的过程。     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白,组Ⅰ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64,而组Ⅱ类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F.本文以组Ⅱ类型的HaSNPV为研究对象,研究组Ⅰ类病毒的GP64能否在组Ⅱ类病毒中正确表达和包装.利用Bac-to-Bac系统,构建了带有AcMNPV膜融合蛋白GP64和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64+egfp+,同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒HaSNPVegfp+,通过对HaSNPVgp64+egfp+感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测,证明GP64可在HzAM1中表达,并被包装入子代BV.     

表达GP64的重组HaSNPV的构建研究

杆状病毒的出芽病毒具有两类不同的膜融合蛋白, 组 I类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白GP64, 而组 II类型的杆状病毒利用的是膜融合蛋白F。本文以组II类型的HaSNPV为研究对象, 研究组I类病毒的GP64能否在组 II类病毒中正确表达和包装。利用 Bac to Bac系统, 构建了带有 AcMNPV膜融合蛋白 GP64 和增强型绿色荧光蛋白的重组病毒HaSNPVgp64 egfp , 同时构建了仅带有增强型绿色荧光蛋白的对照重组病毒 HaSNPVegfp , 通过对HaSNPVgp64 egfp 感染的HzAM1细胞及所产生的子代BV的Western blot检测, 证明GP64可在HzAM1中表达, 并被包装入子代BV。     

重组腺相关病毒小鼠骨骼肌中近红外荧光蛋白表达及活体成像

近红外荧光蛋白因激发光和发射光波长位于近红外区,在动物组织中光吸收和光散射最低,更适宜于动物活体组织的深层成像.构建了一种携带近红外荧光蛋白(near-infrared fluorescent protein,iRFP)713基因的重组表达质粒pAAV-iRFP713,将重组表达质粒与辅助质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)rAAV-iRFP713.重组腺相关病毒表达载体感染体外培养的癌细胞,48h后,荧光显微镜检测显示近红外荧光蛋白在癌细胞中高效表达,荧光明亮.重组腺相关病毒表达载体注射小鼠骨骼肌,48h后,用近红外荧光活体成像系统检测证明近红外荧光蛋白在小鼠骨骼肌中表达较强, 活体组织成像清晰.实验结果表明近红外荧光蛋白在体内体外均能很好地表达并荧光成像,为动物活体组织标记和成像的研究提供新方法.     

GP64表面展示元件与组Ⅱ HaSNPV出芽病毒的融合

利用杆状病毒组ⅠAcMNPV(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus)GP64信号肽(GP64SP),C-末端跨膜区(GP64CTD)及报告基因绿色荧光蛋白(eGFP)构成的表面展示系统(gp64sp-egfp-gp64ctd),同源重组到组ⅡHaSNPV的多角体基因位置,筛选重组病毒。通过激光共聚焦观察,HaSNPV重组病毒感染Hz-AM1细胞后绿色荧光分布在质膜,表明GP64SP可以引导表达产物趋向于细胞膜。病毒感染后,收集并纯化重组的出芽病毒(BV),经Western blot检测,eGFP存在于重组病毒BV中。结果表明,组ⅠGP64表面展示系统中的重要元件GP64SP和GP64CTD能够装配到组ⅡHaSNPV BV上,可以用于组ⅡNPV表面展示目的蛋白。     

AcMNPV类芋螺毒素多肽的抗菌活性分析

类芋螺毒素(CTX)基因存在于多种杆状病毒,编码富含半胱氨酸的多肽。从AcMNPV中克隆了ctx基因,利用AcMNPV杆粒操作系统构建了重组病毒Ac-pFastBac1-Pie1-ctx-eGFP和Ac-pFastBac1-Pie1-ctx。绿色荧光蛋白介导的亚细胞定位显示AcMNPV CTX定位于Tn细胞的细胞膜;抑菌实验表明,重组病毒Ac-pFastBac1-Pie1-ctx感染的胞外产物对金黄色葡萄球菌、微球菌、短小芽孢杆菌等临床致病菌具有显著的抗菌活性,但其作用机制尚需进一步阐明。     

人星状病毒非结构蛋白C末端nsP1a/4蛋白6种删除突变体的构建与表达分析

星状病毒(Human astrovirus,HAstV)是通过引起小肠上皮细胞凋亡从而导致婴幼儿腹泻的重要病原体。课题组前期研究表明HAstV非结构蛋白nsP1aC末端蛋白nsP1a/4是诱导凋亡的主要功能性蛋白,可能含有与凋亡相关的重要结构域。为了探索nsP1a/4蛋白中的凋亡结构域,本研究采用绿色荧光蛋白真核表达载体,根据nsP1a/4蛋白功能性结构域的位置,选择不同的删除位点,构建nsP1a/4蛋白及不同结构域删除的nsP1a/4蛋白突变体,并将其转染BHK21细胞,在转染的24～72h检测重组蛋白在细胞内的表达并进行初步分析。结果显示,24h后荧光显微镜下可观察到融合nsP1a/4蛋白和其突变体的绿色荧光。Western blot分析结果显示7种融合蛋白均能在体外细胞中高效表达,72h表达量明显高于48h。这些结果表明我们构建的nsP1a/4蛋白及其删除突变体可在BHK21细胞中表达,可用于HAstV非结构蛋白nsP1a/4的凋亡结构域研究,从而为进一步研究HAstV分子致病机制提供研究平台。     

增强蛋白与多角体蛋白共包埋的研究

颗粒体病毒的增强蛋白（enhancin)是一种能显著提高核型多角体病毒（NPV）对昆虫感染力的病毒蛋白。构建了一种不形成多角体但表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增强蛋白的重组病毒AcBBH-TnEn,将它与野生型AcMNPV共同感染SF21细胞,经SDS－PAGE、免疫印迹分析、荧光免疫等方法检测证实,增强蛋白与多角体可在同一细胞中同时表达,而且发现所形成的病毒多角体带有增强蛋白。这表明,可以通过混合感染的方式生产带有增强蛋白的病毒多角体。