动物源溶菌酶研究进展

动物源溶菌酶是一种动物体内广泛存在的酶类,它可以水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用.目前溶菌酶已被用作研究蛋白功能、性质以及分子进化的模型.首先介绍了溶菌酶及其分子的晶体结构,溶菌酶基因及其蛋白研究进展,其次介绍了动物源溶菌酶的功能,包括溶菌酶生物学功能和重组蛋白功能活性,重点介绍了溶菌酶基因在转基因工程中的应用研究,最后对动物源溶菌酶研究进行了展望.研究动物源溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力具有重要的指导意义.     

罗非鱼3种C型溶菌酶重组蛋白的制备及与几种鱼虾溶菌酶溶菌谱的比较

应用基因工程技术制备了3种奥利亚罗非鱼C型溶菌酶的重组蛋白,并应用比浊法比较了它们与草鱼C型溶菌酶、G型溶菌酶和斑节对虾C型溶菌酶重组蛋白对无乳链球菌、嗜水气单胞菌等8种细菌的溶菌作用.研究发现,6种重组溶菌酶对这8种菌均具有溶菌活性,但是溶菌活力强弱不一.其中罗非鱼C3溶菌酶对革兰氏阳性菌无乳链球菌的溶菌作用最强,草鱼C型与G型溶菌酶次之;所有重组溶菌酶对革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌均具较强的溶菌活性.与斑节对虾C型溶菌酶、草鱼C型与G型溶菌酶相比,罗非鱼的C型溶菌酶对嗜水气单胞菌具有较强的溶菌作用,且以C1的溶菌活性最强.本研究结果可为选择具较强溶菌活力的溶菌酶应用于养殖生产提供依据,并可为应用转基因技术培育抗病品种提供靶基因.     

日本鳗鲡的C-型和G-型溶菌酶研究

研究以日本鳗鲡(Anguilla japonica Temminck et Schlegel)为研究对象, 根据其基因组数据库, 预测并扩增出2类, 共5个溶菌酶基因, 包括1个C-型溶菌酶和4个G-型溶菌酶, 分别命名为AJLysC、AJLysG1、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4。它们的cDNA全长分别为811、749、1352、1175和733 bp, 编码143、193、185、185和187个氨基酸。SignalP预测表明, AJLysC和AJLysG1的N-端分别包括15和19氨基酸的信号肽, 另外3种溶菌酶没有信号肽。基因组分析显示, AJLysC、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4的基因结构与其他鱼类的同类溶菌酶的基因结构相似, C-型溶菌酶具有4个外显子, G-型则具有5个。但是, AJLysG1的基因结构与其他鱼类G-型溶菌酶不同, 具有6个外显子, 与其他鱼类溶菌酶的蛋白序列比较, 发现AJLysG1缺失其他G-型溶菌酶存在的第2个酶活性位点氨基酸, 即天冬氨酸Asp。AJLysC与其他很多物种的C-型溶菌酶具有较高的同一性, 如与牙鲆的同一性为72.7%。G-型溶菌酶中AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4彼此之间以及与其他物种G-型溶菌酶的同一性相对较高; 而AJLysG1与其他物种以及与其他3种G-型溶菌酶的同一性均不高, 且都在50%以下。组织表达分析显示, 所有5个溶菌酶基因在12种检测的组织中均有表达。C-型溶菌酶在胃及免疫相关组织的表达量较高; G-型溶菌酶在各组织/器官中的表达则差异较大, AJLysG1在皮肤和肌肉中的表达量最高, AJLysG2在免疫组织/器官如血液、头肾、体肾和鳃中表达量较高。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激48h后, 这5个溶菌酶基因在组织/器官中的表达量均有上调, 其中在血液、肠道和头肾等的上调较为显著。此外, 研究尝试重组表达这些抗菌肽, 获得了AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4基因在鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)细胞中的表达, 重组蛋白表现出对溶壁微球菌(Micrococcus lyso-deikticus)生长的明显抑制作用。文章较全面地研究了日本鳗鲡溶菌酶基因的组成和类型及其表达变化, 并重组表达了部分基因, 这为进一步研究这些溶菌酶的功能, 特别是对病原微生物的作用奠定了基础。     

壳聚糖对香鱼溶菌酶活性和hsp70基因表达的影响

壳聚糖是一种理想的水产动物免疫增强剂和饲料添加剂。为了研究壳聚糖对香鱼非特异性免疫机能的影响,探讨其调节机体免疫功能的机理,以香鱼为研究对象,在基础饲料中分别添加0%、0.5%、1.0%、2.0%和4.0%的壳聚糖,连续投喂35 d后测定香鱼肝脏、脾脏和肾脏组织中溶菌酶活性和免疫相关基因hsp70基因表达的影响。结果表明,基础饲料中添加1.0%壳聚糖可使香鱼肝脏、脾脏和肾脏组织中溶菌酶活性显著提高,溶菌酶活性与对照分别提高了0.8倍、3.1倍和5.2倍。定量PCR分析结果表明,添加1.0%壳聚糖可显著促进肝脏、脾脏和肾脏中hsp70基因的表达量,且hsp70基因表达量与溶菌酶活性表现出一定的相关性,表明壳聚糖可通过调节免疫相关基因的表达来调节香鱼的免疫功能。     

人溶菌酶基因的克隆和生物信息学分析

目的:克隆人溶菌酶基因并进行生物信息学分析及构建其原核表达载体方法:采用RT-PCR法扩增人溶菌酶基因,运用相关生物信息学软件对其理化性质、疏/亲水性、功能结构域及蛋白质二级结构等进行分析.将该基因克隆入载体pET32a,PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定.结果:获得约400bp的人溶菌酶基因,其序列与GenBank中公布序列完全一致.生物信息学分析显示人溶菌酶基因编码130个氨基酸,分子量为14.7kDa,理论等电点为9.28,含有一个功能结构域,二级结构主要由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角组成.经PCR、双酶切鉴定和核苷酸序列测定,表明重级表达质粒构建成功.结论:该基因的克隆、生物信息学分析及原核表达质粒的构建为进一步研究其功能奠定了基础.     

溶菌酶的研究进展

溶菌酶在自然界中广泛存在,是一种与单核-巨噬细胞系统有关的非特异性防御机制。人溶菌酶在临床上具有潜在的使用价值。由于来源有限,利用基因工程技术从细菌或酶母中生产人溶菌酶实现产业化,是解决其供需矛盾的有效途径。有关溶菌酶抗菌功能以外的其它未知生物学作用,也是当前研究的热点。     

反刍动物溶菌酶研究进展

目前,抗生素滥用带来的副作用日益凸显,寻找抗生素的有效替代品显得尤为迫切。溶菌酶能水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用,在动物尤其是反刍动物体内广泛存在。本文讨论了反刍动物溶菌酶的来源与分布、基因序列、蛋白结构和酶学性质、蛋白功能及活性,对其耐酸分子机理进行了归纳总结;同时阐述了反刍动物溶菌酶基因的进化研究,最后对反刍动物溶菌酶研究进行了展望。研究反刍动物溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力意义重大。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。       

肺炎链球菌假想的溶菌酶样蛋白的活性分析和鉴定

目的 探索肺炎链球菌中一种假想的溶菌酶样蛋白的活性.方法 生物信息学分析该基因的功能结构域;利用长臂同源PCR对该基因进行敲除,观察D39野生菌和缺陷菌在生物学性状的改变;利用底物PNP-（GIcNAc）和溶壁微球菌,构建过表达载体,绘制生长曲线,对截断和全长蛋白的溶菌酶活性进行鉴定.结果 生物信息学分析结果显示该基因的编码产物为β-1,4-N-乙酰胞壁酸糖苷酶,属于糖基水解酶25家族;野生菌为长链生长,缺陷菌呈短链状;溶菌酶和假想的溶菌酶样蛋白均可使底物释放出游离的对硝基苯酚,A405nm吸光度值分别为1.166和0.792;同时也可使得溶壁微球菌发生溶解;含过表达质粒的肺炎链球菌较之野生菌,溶解较快.结论 假想的溶菌酶样蛋白具有溶菌酶活性,是一种新的溶菌酶.     

融合表达HLH结构域对猪溶菌酶抗菌活性的影响

[目的]通过遗传操作提高猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌的活性。[方法]对猪溶菌酶进行分子模拟,得到了包含功能肽的螺旋-回环-螺旋(HLH)结构域,将HLH编码基因与猪溶菌酶基因N端或C端进行融合,于大肠杆菌中诱导表达,经复性、纯化后检测其抗菌活性,并利用原子力显微镜和荧光染色对抗菌活性较高的融合蛋白杀菌机制进行初探。[结果]与对照组相比,N端和C端融合蛋白基本保持了猪溶菌酶对革兰氏阳性菌的活性;同时,两种融合蛋白对革兰氏阴性菌的抗菌活性均显著增强,其中N端融合产物活性更高,它对大肠杆菌ATCC 10798、大肠杆菌ATCC 25922、克雷伯氏菌TR5、铜绿假单胞菌ATCC 15442、沙门氏菌CMCC(B)50335的抗菌系数分别为1.64、1.24、2.56、1.72和1.42,最低抑菌浓度分别为90μg/mL、100μg/mL、40μg/mL、80μg/mL和100μg/mL。经检测,该融合蛋白能显著增强革兰氏阴性菌细胞膜的通透性。[结论]通过融合表达自身来源的HLH结构域,猪溶菌酶抗革兰氏阴性菌活性得到了显著提升,可为其它溶菌酶抗菌活性的提高提供参考。