番茄Sl_OASTL/LCD基因的克隆与表达及其对侧根生长的作用

硫化氢（H2S）是植物中最新发现的一种气体信号分子,高等植物中内源H2S主要由L-型半胱氨酸脱巯基酶（LCD）和D-型半胱氨酸脱巯基酶（DCD）两类蛋白产生。我们的前期研究结果表明外源H2S能够促进植物侧根发育。为了研究内源H2S的产生机制及H2S与一氧化氮（NO）在调控侧根发育中的作用,本实验以番茄幼苗为材料,克隆了编码H2S合成酶基因Sl_OASTL/LCD;研究抑制内源H2S对NO诱导侧根发育的影响;并研究了NO对Sl_OASTL/LCD表达的影响。结果显示：（1）番茄根中存在3个O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶基因（Sl_OASTL1、Sl_OASTL2、Sl_OASTL3）。比对和结构分析显示,Sl_OASTL1为编码H2S合成酶基因LCD,所以将Sl_OASTL1命名为Sl_OASTL/LCD;启动子区域分析显示,Sl_OASTL/LCD基因上游含有多个响应NO和植物激素信号的保守基序。（2）与对照相比,内源H2S合成酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸（PAG）和内源H2S清除剂亚牛磺酸（HT）处理均能抑制侧根生长。（3）外源NO供体硝普钠（SNP）显著诱导侧根生长。（4）PAG和HT处理均能够抑制NO对侧根生长的诱导作用。（5）RT-PCR分析显示,SNP处理能够显著诱导幼苗根中Sl_OASTL/LCD的表达。上述结果表明,NO可能通过调控Sl_OASTL/LCD的表达产生内源H2S诱导番茄幼苗侧根发育。     

H2S作为植物个体间交流的气体信号分子

植物遭受到昆虫取食、创伤及非生物胁迫时,会向环境中释放多种挥发性物质,直接或间接地帮助受胁迫植株抵抗伤害。同时,这些挥发性物质向附近的健康植株传递信息,以应对可能到来的侵害。硫化氢(H2S)作为细胞内气体信号分子提高植物对多种胁迫的抗性已有报道,本论文对H2S是否作为植物个体间传递信息的信号分子进行了研究。结果表明:40%PEG8000处理可以使谷子、白菜、番茄和拟南芥Col-0植株所在环境空气中H2S含量升高;谷子和拟南芥Col-0植株经PEG8000处理后,可以使邻近的非胁迫植株叶片的H2S含量升高和H2S响应基因表达变化,并诱导非胁迫植株气孔关闭;而拟南芥内源H2S产生酶基因LCD和DES1双基因突变体lcd/des1经PEG8000处理,不能引起空气中和邻近植物的H2S含量升高,不能诱导邻近植株气孔关闭。本论文表明,H2S可以作为植物个体间的信息传递分子;即受胁迫植物通过向周围环境中释放H2S,向邻近植株提供胁迫预警信息,可能对种群的生存有重要意义。     

外源硫化氢对冷胁迫下白菜幼苗生长和光合作用的影响

硫化氢(H2S)是调节植物生长发育和响应胁迫的重要气体信号分子,为了增加对白菜(Brassica rapavar.pekinensis)应答冷胁迫生理机制的理解,该研究分析了4℃冷胁迫条件下外源H2S(5μmol·L-1硫氢化钠水溶液熏蒸24h)预处理对白菜幼苗生长、光合作用以及相关基因表达水平的影响。结果发现:(1)冷胁迫诱导后白菜内源H2S主要生成酶编码基因LCD、DCD、DES的表达水平极显著上调,并伴随H2S产率的显著增加,暗示二者之间存在着潜在紧密联系。(2)在冷胁迫条件下,外源H2S预处理的白菜幼苗地上部分高度、叶宽和相对含水量等指标均比对照表现出明显优势;其体内脯氨酸、可溶性糖以及光合色素含量大幅升高,光合速率显著提升,光合作用中部分捕光蛋白、铁氧还蛋白和硫氧还蛋白编码基因表达量同时显著上调。研究表明,生理浓度H2S预处理可通过诱导上调白菜幼苗光合作用的相关基因表达量和提升净光合速率,提高其光合作用强度,促进渗透调节物质积累,有效缓解冷胁迫对其造成的损伤,维持冷胁迫下白菜幼苗的生长。     

转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

采用超声波辅助花粉介导方法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase导入早熟型大白菜自交系20-19-3,最终获得了5个转基因大白菜优良自交系纯合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以转基因大白菜株系和非转基因对照植株为材料,对BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遗传规律、基因表达及抗虫性进行进一步分析。结果显示:(1)转化株后代多代(T_1~T_4)PCR、Southern blotting等分子跟踪检测表明,目的基因已成功导入受体植株,且能够稳定遗传;用该转基因方法对大白菜进行基因转化所获得的转基因植株分析显示,外源基因多数以多拷贝形式整合于核基因组,少部分外源基因以单拷贝形式整合。(2)Elisa分析结果证明,所导入的外源基因可高效表达,T4代株系新鲜叶片中表达产物量最高达到0.069μg·g~(-1)左右。(3)转基因株系田间抗虫性统计分析表明,转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提高2~3级。研究认为,转BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表达可有效提高大白菜的抗虫性。     

植物中硫化氢和一氧化氮信号的交互作用

植物在整个生长、发育和响应环境胁迫过程中,涉及多种信号分子如钙(Ca2+)、活性氧(ROS)、硫化氢(H2S)和一氧化氮(NO)等的交互作用。近年来,H2S和NO都被认为是植物中重要的第二信使,参与种子的萌发、植物的生长与发育和对环境胁迫的响应和适应,并且在这些生理过程中,存在H2S和NO信号的交互作用。基于H2S和NO信号的最新研究进展,对H2S和NO信号在植物中的合成和分解代谢,以及它们在植物细胞中的动态平衡进行了讨论,并对植物中H2S和NO信号的交互作用,即二者的化学反应、作用于共同的靶分子、调节彼此代谢酶和其他信号途径等方面进行了归纳和总结。     

ipt基因促进矮牵牛遗传转化效率及热激启动子驱动基因删除

本研究主要探讨ipt基因对矮牵牛遗传转化不定芽诱导影响及拟南芥热激启动子hsp18.2驱动重组酶基因flp的热诱导外源基因删除表达载体在矮牵牛中的基因删除效果.本研究中将植物表达载体pBin-hsp18.2:flp-35S:ipt及对照载体pBin-hsp18.2:flp遗传转化矮牵牛,以获得转基因植株,分析比较不定芽的诱导和转基因植株进行的热激基因删除.研究结果表明,ipt基因可促进矮牵牛遗传转化过程中不定芽的诱导,其不定芽诱导率为21.5%,显著高于对照的8.7%.在44℃,6 h,热激6次的条件下,转基因矮牵牛植株表型恢复正常,经 GUS蛋白表达分析及PCR、RT-PCR检测,证明外源基因已经被删除.转基因矮牵牛基因删除效率最高可达43.8%.本研究为ipt基因在一些遗传转化困难植物转基因中的应用奠定了基础.     

查尔酮合酶基因对转基因植物花色和育性的影响

查尔酮合酶 ( chalcone synthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶 ,它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。从矮牵牛 ( Petunia hybrida)特定发育阶段的花瓣的 c DNA中 ,克隆到查尔酮合酶基因 ,并正向插入到原核表达载体和含有花椰菜花叶病毒 Ca MV 35 S启动子的真核表达载体中 ,在原核中得到高效表达 ,并通过土壤农杆菌介导的方法转化矮牵牛。转基因植物的花色不但发生了明显的变异 ,其育性也受到了影响 ,不能产生正常花粉粒 ,成为雄性不育植株。 Northern杂交表明 ,转基因植物花瓣中 ,内源及外源查尔酮合酶基因转录均受到抑制     

干旱胁迫下H_2S信号增强植物叶片的光合作用

干旱胁迫是影响农作物产量最重要的环境因素之一。硫化氢(H_2S)作为第三种气体信号分子在植物体内具有多样且积极的生理功能。目前已了解,H_2S在响应植物干旱胁迫应答以及增强植物光合作用的过程中发挥重要作用,但关于内源性H_2S对干旱胁迫下植物光合作用的调节机制未见报道。该研究以拟南芥哥伦比亚野生型(wild type Col-0,WT)、H_2S产生酶编码基因DES缺失突变体des以及H_2S产生酶编码基因DES过表达突变体OE-DES为实验材料,研究内源性H_2S对干旱胁迫下拟南芥光合作用的调节机制。研究结果显示,植株在正常生长条件下,内源性H_2S促使叶片净光合速率、蒸腾速率、叶绿素含量显著升高;植株遭受干旱胁迫时,内源性H_2S可以显著上调Rubisco和Rubisco活化酶(Rubisco activase,RCA)的表达水平,保护叶绿体结构的完整性,促使叶片净光合速率显著上升,维持叶片相应的蒸腾速率,并且引起叶片气孔关闭和胞间CO_2浓度显著升高。     

植物维生素C过氧化物酶研究进展

维生素C过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是植物体内的重要酶系,是植物AsA-GSH氧化还原途径的重要组分,是清除H2O2(特别是叶绿体中的H2O2)的关键酶.本文综述了维生素C过氧化物酶表达调控方面的研究进展,包括逆境(干旱胁迫、空气污染、微量元素缺乏、离子胁迫、过度光强、照射以及盐胁迫等)与APX的表达调控、植物细胞程序性死亡(PCD)与APX的表达调控、植物生长发育与APX的表达调控、植物进化与APX表达调控等.植物体内的APX基因包括基质和类囊体两类,不同的APX基因序列存在一定差异,本文还综述了这两类APX基因在植物方面的分离和克隆进展情况,同时对APX基因的遗传转化进行了简要回顾,最后指出了APX今后的研究方向.     

遗传转化KN1基因促进毛果杨外植体再生

已有研究表明玉米同源异形盒(homeobox)基因Knotted1(KN1)超量表达会导致转基因烟草、拟南芥和番茄等植物中细胞分裂素含量增加,提高转化效率。由于木本植物遗传转化困难,且毛果杨可作为木本植物研究的模式植物,因此,本研究利用农杆菌介导法,将35S启动子驱动的玉米KN1(35S::KN1)基因导入毛果杨,并分析KN1基因表达对毛果杨再生率的影响。研究结果表明,经GUS组织化学染色及PCR分子鉴定,KN1基因已经成功导入毛果杨幼苗;KN1基因对毛果杨外植体愈伤诱导率影响不明显,但单个外植体芽诱导率比对照高0.96倍,毛果杨的再生频率明显提高;与移栽成活的野生对照植株相比,转化KN1基因植株出现叶片变小,叶色变深,在叶片边缘产生裂片,分枝增加,无顶端优势等特殊表型。本研究中KN1基因引起转化植株表型变化,因此在毛果杨的遗传转化中,可作为一种有效的正向选择标记基因。     

转PvPGIP2基因小麦的获得与纹枯病抗性鉴定

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种植物防卫蛋白,可阻止一些病原真菌的侵害。本研究克隆出扁豆PvP-GIP2基因编码序列,构建了受玉米泛素(ubiquitin)启动子控制的PvPGIP2基因表达载体pA25-PvPGIP2;采用基因枪法将pA25-PvPGIP2转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4000块,获得了203株再生植株。PCR检测出阳性植株65株,转化率为1.625%。对转PvPGIP2基因小麦T1～T2植株,进行外源基因的PCR、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病抗性鉴定。结果表明,转入的PvPGIP2能够在转基因小麦中遗传、转录与表达;PvPGIP2基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病的抗性。     

大白菜orf224基因植物表达载体的构建及遗传转化

为了创制新的大白菜雄性不育材料,双酶切重组质粒pMD18-T-CMS7311-orf224和表达载体pWR306后,将CMS7311-orf224基因与线性表达载体pWR306进行定向连接,构建了细胞质雄性不育线粒体基因CMS7311-orf224的植物表达载体pWR-CMS7311-orf224,通过酶切和PCR验证pWR-CMS7311-orf224载体构建正确.采用快速冻融法,将表达载体导入农杆菌EHA105,转化大白菜材料06J28,对转化植株的GUS、PCR和RT-PCR检测表明,获得了2个大白菜转基因植株.     

白菜紫色性状RAPD连锁标记的筛选与染色体定位研究

以紫菜薹自交系95T2-5、大白菜自交系94S17-1及其F1、F2、BC1植株为材料,进行RAPD分析,从640个随机引物中筛选出2个引物S79和S123,分别能扩增出与紫色性状连锁的条带S79-934和S123-750。连锁分析发现,标记S79-934和S123-750与紫色基因间的遗传距离分别为13.73cM和18.65cM,并且位于紫色基因的两边。回收S79-934特异带,克隆转化并测序,比较分析表明其与大白菜1号染色体上已知克隆KBrH077A05的全序列(113253bp)有99%的相似性,初步推断控制紫色性状的主基因位于大白菜1号染色体上。     

植物萜类合成关键基因DXS研究进展

萜类物质是自然界中广泛存在的一类天然化合物,对植物、动物和人类都有重要价值。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)对萜类物质合成调控起关键作用,是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个酶,也是该途径的一个限速酶,亚细胞定位于类囊体中,具有质体转运肽序列和3个功能结构域:TPP结合结构域、转酮醇酶结构域和嘧啶结合结构域,可用高效液相色谱法测定其活性。目前已从178种植物中克隆分离到DXS基因,按蛋白同源性可分为3类:DXS1、DXS2和DXS3。DXS基因表达具有组织特异性、昼夜节律性,与花朵、果实发育程度和品种有关。转外源或内源DXS基因的植株过表达或抑制表达都会引起植物光合色素(如叶绿素和类胡萝卜素)、内源激素(如脱落酸和赤霉素)和单萜等萜类物质含量的改变。重点综述了DXS蛋白的特性、基因的类型、基因表达、调控和遗传转化方面的研究进展,以期为植物育种和代谢调节提供理论和实践参考。     

‘新陆早33号’棉花转基因体系建立及AtPGIP1基因的导入

利用生物技术方法对棉花进行遗传改良主要限于有效的遗传转化系统。以新疆主栽优良陆地棉品种‘新陆早33号’为材料,利用下胚轴作为外植体对影响农杆菌介导的棉花遗传转化及体细胞胚胎发生的因素进行研究,成功建立了除草剂Basta筛选的棉花遗传转化技术体系。同时将植物抗病相关基因多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因AtPGIP1导入棉花,经过对再生转化植株的PCR鉴定,初步证明外源基因已经整合到棉花基因组。研究发现:Basta是棉花遗传转化中很有效的筛选剂,低浓度Basta(2.5mg/L)就能够获得很好的筛选效果;较低的共培养温度(20℃)及合适的农杆菌浓度(OD600=0.5)有助于提高转化效率。该研究结果表明,‘新陆早33号’具备作为棉花优良遗传转化受体的基本特征,研究中获得的15株AtPGIP1转基因植株经PCR分子检测均为阳性植株。该研究为新疆棉区棉花分子生物学研究及转基因育种研究奠定了重要基础。     

鸭梨PAL基因的反义遗传转化及表达分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin ammonia-lyase,PAL,EC4.3.1.5)是植物通过苯丙烷代谢途径合成木质素的关键酶和限速酶,其通过影响木质素的合成而与果实中石细胞的分化、发育及果实品质密切相关。为了降低鸭梨中苯丙氨酸解氨酶的含量,该研究利用反义PAL基因遗传转化鸭梨、降低鸭梨内源PAL基因的表达。结果表明:(1)采用RT-PCR技术,利用根据Gen Bank中西洋梨PAL基因序列设计特异性引物,扩增得到496 bp的鸭梨PAL基因片段。(2)将扩增片段反向插入载体p BI121的MCS区域,构建植物PAL基因反义表达载体p BI121-As PAL。接着采用电转化法将反义表达载体转入农杆菌EHA105中,并制备出农杆菌工程菌液。(3)利用农杆菌介导法对鸭梨组培苗叶片外植体进行遗传转化,得到23株转基因鸭梨苗。PCR检测证实PAL反义基因片段转入鸭梨中,实时定量PCR检测表明转基因鸭梨苗体内PAL基因表达量均有所降低,为非转基因苗的65%~75%。该研究结果表明利用反义RNA技术获得了抑制内源性PAL基因表达的转基因鸭梨植株,为改善鸭梨果实品质、改良品种奠定了基础。     

花同源异型基因FBP2调节叶片中过氧化物酶的表达

对碧冬茄和烟草的野生型以及FBP2转化植株(transformant)叶片中过氧化物酶 (POD)的特性做了分析 ,结果表明FBP2在花中的表达可以调节叶片特异POD的表达 ,并影响其活性。此外 ,FBP2在花中的表达还影响叶片内源植物生长物质的水平以及多酚氧化酶 (PPO)和过氧化氢酶 (CAT)的活性。结果表明 :花同源异型基因不仅调控花器官的发育 ,而且参与营养器官代谢的调节 ,使之适应于生殖器官的生长发育     

H_2S与Ca~(2+)协同增强谷子对Cr~(6+)胁迫的耐受

继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后,第三种气体信号分子硫化氢(H2S)对植物体生长发育和环境胁迫应答的调控正在受到越来越多的关注。钙离子(Ca2+)是重要的第二信使,参与植物对多种胁迫的响应。该实验以谷子这种抗逆性较强的作物为材料,对其响应六价铬(Cr6+)胁迫过程中H2S和Ca2+信号的互作进行了研究。结果表明,Cr6+胁迫显著激活谷子幼苗的H2S产生系统,外源H2S预处理能明显降低Cr6+胁迫对谷子根尖细胞的损伤,而H2S的合成抑制剂羟胺(HA)预处理,使得Cr6+对谷子的毒害增强;进一步实验发现,H2S能激活Ca2+信号下游相关基因的表达,同时Ca2+能增强H2S的产生,表明在植物体内H2S和Ca2+信号存在复杂的联系。该研究也证明,H2S和Ca2+可以通过调节重金属离子转运蛋白增强谷子对Cr6+的耐受。     

转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(NicotianatabacumL.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptII)及石蒜凝集素基因(lra)。通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株。Westernblot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同。对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔31的分离比方式遗传。抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用。首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性。石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用。     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。