密度梯度离心法同时分离新生大鼠原代心肌细胞与成纤维细胞

本文旨在探讨一种改良的同时分离新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞的方法,以建立良好的原代心肌细胞及成纤维细胞研究模型。无菌状态下取Wistar乳鼠(出生不超过2天)心室,用II型胶原酶消化,控制消化时间及次数、搅拌速度、离心次数和速度等,结合Percoll密度梯度离心法分离心肌细胞及成纤维细胞,进行体外培养,观察细胞形态,继而用0.2%台盼蓝染色检测细胞存活率,免疫荧光染色法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)、波形蛋白(Vimentin)及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达,分别用于鉴定心肌细胞和成纤维细胞纯度。结果显示,本方法5次分离的心肌细胞平均存活率达92%,纯度达95%以上,细胞生长状态良好,可见贴壁自发搏动;成纤维细胞平均存活率达96%,纯度达94%。本方法能同时获得新生大鼠原代心肌细胞和成纤维细胞,具有很高的产量、存活率及纯度,且操作简便,耗时短,重复性好,是一种较为理想的原代细胞分离、培养方法,可满足各种后续实验要求。     

改良法分离培养SD新生乳鼠原代心肌细胞*

目的:建立一种稳定、快速的SD新生乳鼠原代心肌细胞分离培养改良方法。 方法:取SD新生乳鼠心室,0.12%Ⅱ型胶原酶消化,Percoll密度梯度离心结合5-溴脱氧尿嘧啶(5-BrdU)化学抑制法纯化心肌细胞,体外培养于含5%马血清的改良DMEM/F12中,次日更换为普通含10%胎牛血清的高糖DMEM继续培养,并比较此改良方法与传统差速贴壁法的差异。 结果:改良法获得的心肌细胞生长良好,接种24 h 后几乎全部贴壁生长,细胞呈三角形、梭形或不规则形,个别细胞出现自主搏动,频率为10～30 beats/min不等。48 h后心肌细胞变长伸出伪足,部分细胞呈现同步搏动, 频率接近50～80 beats/min。72 h后心肌细胞成菊花样交织成网,自发搏动趋于同步,频率加快至80～100 beats/min;96 h后细胞聚集成簇,呈岛屿样,同步搏动频率在100～120 beats/min左右,一周内细胞状态良好。改良法纯化原代心肌细胞的得率((1.17±0.15)×10⁶ vs (1.21±0.22)×10⁶,P＞0.05)和存活率与传统差速贴壁法相当(93.3%±1.4% vs 92.2%±0.7%, P＞0.05 ),但是改良方法获得的原代心肌细胞纯度更高 (94.7%±2.1% vs 89.5%±1.3%, P＜0.05),且用时较短((3.1±0.4)h vs (4.3±0.3)h, P＜0.01)。 结论:改良法获得心肌细胞耗时短、纯度高、结构功能保存完整,且实验重复和稳定性好,是一种理想且简单易行的的原代心肌细胞分离培养方法。     

小鼠主动脉平滑肌细胞的分离培养及鉴定

目的:建立分离培养小鼠原代主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的方法并检测其生长特性。方法:剥离小鼠主动脉中膜层,分别采用组织块培养法及胶原酶消化法分离培养小鼠主动脉来源的原代VSMC,免疫荧光法检测细胞的纯度和分化状态;3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法测定小鼠主动脉VSMC传代细胞的生长、增殖特性。结果:组织块培养法培养组织块8d后,细胞从组织块边缘爬出,18 d后细胞汇合度达到80%以上后传代;胶原酶消化法分离培养的细胞生长7 d后,汇合度可达80%,此时进行传代;2种方法获得的细胞进行免疫荧光染色,结果显示细胞传至第3代时纯度在95%以上,传至第8代时分化状态并没有改变;MTT法显示细胞生长3~5 d时处于指数生长期。结论:本研究建立了2种可靠稳定的分离和培养小鼠主动脉VSMC的方法,VSMC纯度高,多次传代后细胞特征稳定。     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。     

培养的小鼠心室肌细胞动作电位的波型分析

本实验自新生昆明小鼠心室分离心肌细胞,用80％MEM+20％小牛血清培养四天,成功地制备了保持在体心室肌细胞电生理特性,并能自发发放快反应动作电位的培养心肌细胞模型;并根据V_(max)的区别,把培养的小鼠心肌细胞动作电位分为快反应,中间过渡型与慢反应三种类型。     

细胞周期素D在培养的新生大鼠心肌细胞中的表达

目的探索一种快速分离和培养新生大鼠心肌细胞的方法,研究心肌细胞中细胞周期素D表达的变化规律.方法心肌细胞分离、纯化及培养后用倒置显微镜观察其形态变化,免疫细胞化学染色及图像分析方法检测培养第1～21天新生大鼠心室肌细胞周期素D的表达.结果心肌细胞核内细胞周期素D表达量逐渐下降,第2天与第1天比较,差异无显著性(P>0.05),从第3天开始差异有显著性(P<0.05,P<0.01).结论新生大鼠心肌细胞出生后早期体外培养的前3天有一定增殖能力,但以后呈下降趋势.     

改良组织块法培养小鼠成骨细胞的研究

目的 探讨简便、经济、高效的成骨细胞培养方法.方法 取新生乳小鼠的颅骨,用改良的组织块法分离培养成骨细胞;从细胞的形态学、增殖、碱性磷酸酶染色、矿化结节茜素红染色及骨钙素基因表达水平等方法鉴定、比较培养的成骨细胞.结果 分离培养的成骨细胞生长状态良好,纯度较高,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性,骨钙素基因表达水平明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P＜0.05).比较1～4次分离培养的成骨细胞在形态、增殖及分化功能上差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 改良的组织块法分离培养乳小鼠的颅骨可获得大量纯度较高的成骨细胞,节约经费、时间,操作简便.     

成年小鼠心肌细胞的分离培养及鉴定

目的探讨成年小鼠心肌细胞分离培养的方法,评价心肌细胞的存活状况。方法应用改良Langendorff方法进行成年小鼠心脏灌流,分离并培养心肌细胞,评价杆状心肌细胞的比例变化。台盼蓝染色判定心肌细胞活力,应用毒胡萝卜素(thapsigargin)治疗心肌细胞24 h后,WST方法测定细胞生存率。结果在每个成年小鼠心脏分离了40~60万的心肌细胞,台盼蓝染色结果68%为存活心肌细胞。心肌细胞培养1 h2、4 h及48 h后,杆状心肌细胞的比例分别为70%、50%及30%。心肌细胞生存率随着毒胡萝卜素浓度的增加逐渐减低,其中1、5及10μmol/L毒胡萝卜素的生存率明显低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论应用改良Langendorff方法及严格控制心脏灌流培养的条件,可以成功地分离培养成年小鼠心肌细胞,有助于进行细胞分子水平的研究。     

SD大鼠视网膜小胶质细胞原代培养方法的改良

目的对经典的原代视网膜小胶质细胞体外纯化培养方法进行简单的改良以提高细胞产量。方法在视网膜小胶质细胞原代培养过程中以McCarthy等的经典方法为基础,寻找适当的初始种植密度,并在初次振荡分离后继续培养以获得多次产出,使用免疫细胞化学染色方法进行小胶质细胞纯度鉴定。结果视网膜小胶质细胞原代培养最宜初始种植密度为1×106/mL,多次分离纯化获得的视网膜小胶质细胞均达到97%以上的纯度。结论视网膜小胶质细胞原代培养过程中,以适当的初始种植密度和多次振荡分离方法可在保证有效纯度的基础上提高细胞产量。     

EDU免疫荧光法检测整合素连接激酶（ILK）高表达对新生大鼠心肌细胞DNA合成的影响

目的：通过EDU免疫荧光法观察整合素连接激酶（Integrin-Linked Kinase,mK）在新生大鼠心肌细胞内高表达后对心肌细胞DNA合成的影响。方法：取新生（1-3天内）大鼠原代心肌细胞,培养72小时后随机分为正常对照组、ILK转染组。对照组转染重组腺病毒载体（adeno-GFP）,ILK纽转染重组腺病毒载体＋ILK基因（adeno-ILK）。转然成功后48小时将两组心肌细胞分别通过5-乙基-2-脱氧尿嘧啶核苷（EDU）免疫荧光法测定心肌细胞DNA合成。结果：ILK转染组心肌细胞内DNA合成较对照组明显增加（P〈O．05）。结论：ILK高袁达具有促进新生大鼠心肌细胞的DNA合成的能力。