一种新型的CRISPR/Cas9-hLacI双链DNA供体适配基因编辑系统

在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA （double-stranded DNA,dsDNA）供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌（Escherichia coli）乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌（Streptococcus pyogenes）源的SpCas9和路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统（donor adapting system,DAS）。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复（homology-directed repair,HDR）效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。     

植物CRISPR/Cas9多基因编辑载体构建和突变分析的操作方法

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是植物基因功能研究与作物改良的有效工具.为此,本实验室开发了高效的CRISPR/Cas9植物多基因编辑载体系统.本载体系统包括6个双元载体和12个含有不同U3/U6启动子的sg RNA中间载体,可满足对单子叶和双子叶植物的遗传转化以及不同抗生素筛选的要求,具有简便、高效,可同时对多基因进行编辑的特点.此外,为了能更高效地应用基因组编辑技术,还开发了一站式在线分析工具包CRISPR-GE.为方便研究人员利用CRISPR/Cas9系统进行植物基因组编辑,本文提供了从靶点选择、CRISPR/Cas9多靶点双元载体构建,以及对靶点突变序列的测序分析等详细的操作方法,以及常见的问题解答.     

烟草NtSKOR1基因的克隆及功能分析

该研究利用拟南芥AtSKOR蛋白序列,通过NCBI的Blast搜索获得烟草NtSKOR1基因CDS序列。设计全长CDS扩增引物,通过RT PCR方法从栽培烟草中克隆得到NtSKOR1基因,对其进行生物信息学、表达特性等分析,并利用CRISPR/Cas9技术获得NtSKOR1的敲除材料。结果表明：(1)NtSKOR1基因CDS由2 466 bp核苷酸组成,编码821个氨基酸,推测NtSKOR1蛋白等电点为6.36,分子量为94.21 kD。(2)NtSKOR1定位于细胞膜,有6个跨膜区,无信号肽序列;NtSKOR1蛋白含有孔形成区(P)及锚定蛋白区(ANK)等典型SKOR类蛋白功能域。(3)进化树分析表明,烟草NtSKOR1蛋白与番茄和马铃薯的SKOR蛋白遗传距离最近,与禾本科植物的SKOR蛋白遗传距离较远。(4)组织特异性表达分析表明,NtSKOR1基因主要在烟草根中表达,其表达模式与拟南芥一致;钾胁迫处理后,NtSKOR1基因呈先降低后升高再降低的表达模式。(5)CRISPR/Cas9敲除NtSKOR1基因,烟草叶片钾含量显著降低,表明NtSKOR1基因是控制烟叶钾离子的关键基因之一。该研究结果为解析烟草钾离子吸收转运的分子机制提供重要依据。     

沙棘hrh miR319e靶向转录因子AP4调控种子发育的研究

为探讨沙棘hrh miR319e与转录因子AP4间的靶向关系,并分析其在种子发育过程中的表达,以不同发育期的种子为材料,运用RNAhybrid软件预测hrh miR319e成熟体序列与其候选靶基因AP4的3′ UTR区的结合位点,构建pcDNA3.1+pmirGLO AP4和pcDNA3.1 hrh mir319e+pmirGLO AP4载体,用双荧光素酶报告基因检测方法验证hrh miR319e与候选靶基因AP4间的靶向关系,并采用qRT PCR方法分析hrh miR319e与AP4基因在沙棘不同发育期种子中的表达变化。结果显示：(1) 生物信息学预测AP4 3′ UTR区与hrh miR319e成熟体序列完全互补。(2) 荧光检测显示pcDNA3.1 hrh mir319e+pmirGLO AP4质粒显著抑制荧光素酶活性(P< 0.001)。(3) 不同发育期种子中hrh miR319e的表达量总体呈现出先明显上升后明显降低的变化趋势,而AP4基因的表达量则呈现出先降低后上升的趋势;当hrh miR319e的表达量在花后80 d达到最高水平时,‘新俄3号’种子中为3.146、‘绥棘1号’种子中为4.298、‘杂56’种子中为3.892,AP4的表达量则为种子不同发育期的最低值,‘新俄3号’中为0.427、‘绥棘1号’中为0.526、‘杂56’中为0.451。研究表明,沙棘AP4是hrh miR319e的靶基因,hrh miR319e AP4模块在沙棘种子发育过程中存在负调控关系。该研究结果为深入了解沙棘种子发育机制及大粒品种培育提供了理论依据。     

基于CRISPR/Cas9系统构建绵羊VASA基因敲入载体及验证

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础。采集性成熟前后即3月龄（3-month-old,3M）和9月龄（9-month-old,9M）绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析。设计靶向VASA基因的向导RNA （guide RNA,gRNA）,并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞。结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率。结果表明,VASA基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加（P<0.01）,且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中。利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9系统激活后,耳成纤维细胞成功表达VASA基因。结果提示,VASA基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段。     

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因．以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B．anthracis AP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌．然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定．最终建立了Cre-LoxP系统在B．anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因.     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥GGB基因突变体的鉴定

GGB是抗旱负调控基因。为了获得拟南芥ggb突变体材料,构建了以拟南芥U6启动子驱动GGB sgRNA的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。将构建好的编辑载体利用农杆菌介导的浸花法转化野生型拟南芥。对转基因后代GGB基因的测序结果分析发现,在靶位点处有缺失4个碱基和增加1个T碱基的2种突变体产生。分别对野生型拟南芥和上述2种ggb突变体进行半定量RT PCR分析结果显示,突变体材料中几乎检测不到GGB基因表达,说明获得了GGB基因敲除突变体。对野生型和ggb突变体叶片失水率、耐旱表型及单株种子量的测定结果表明,与野生型相比,拟南芥GGB基因突变后,叶片失水率显著减少,抗旱性明显增强,而单株种子量却并没有改变。研究表明,GGB是一种理想的作物分子育种的候选靶基因,获得的突变体为今后从农作物中克隆的GGB同源基因进行功能互补验证提供了有用的遗传材料。     

CRISPR/Cas9技术在生物医学领域的非病毒及病毒载体

规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)及CRISPR相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统是一种新型基因组编辑技术,能够靶向干扰或修复基因组的特定基因.来自细菌或人工改造的CRISPR/Cas9系统已经由生物学家发现或构建,Cas9核酸酶及单链导向RNA(sgRNA)是CRISPR/Cas9系统的主要组成成分.该系统被广泛应用于疾病治疗新靶点的发掘,基因功能的鉴定,动物模型的建立以及基因治疗药物的开发.CRISPR/Cas9系统已经通过突变或修正疾病相关基因来部分缓解或彻底治愈某些病症.然而,如何有效递送CRISPR/Cas9至目标细胞及靶器官仍然是运用该技术所面临的挑战之一,这影响着该系统稳定和精准的基因编辑能力.本文主要综述Cas9mRNA,Cas9蛋白或编码Cas9基因及相应sgRNA载体的递送系统.递送Cas9蛋白的非病毒载体能够维持Cas9的靶向作用,减少脱靶效应;递送sgRNA和供体模板的病毒载体能够改进基因编辑及同源修复效率.安全,有效及可规模化生产的递送载体将会推进CRISPR/Cas9技术在人类基因治疗领域中的应用.     

利用CRISPR/Cas9核酸酶靶向细菌必需基因的特异性抗菌剂研究（英文）

CRISPR/Cas9核酸酶是一种高效和精确的基因组DNA编辑工具。目前,CRISPR/Cas9被开发成一种新型抗菌剂,通过靶向破坏目标基因,例如抗生素耐药基因来诱导细菌死亡。本研究利用CRISPR携带多靶点优势,同时靶向大肠杆菌必需基因gyrA、gyrB和folA,以达到杀菌作用。本设计针对3个内源基因的CRISPR系列载体,分别含有1个、2个或3个靶点。当IPTG诱导Cas9表达后,CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA (trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)复合物募集Cas9切割靶基因,导致细菌死亡。随着crRNA中靶点数量的增加,杀菌效率显著提高。当含有3个靶点的crRNA作用于细菌基因组时,杀菌效率达到99.35%。此外,在存活的大肠杆菌中,crRNA表达质粒的靶序列和直接重复序列发现碱基缺失,而内源靶基因和Cas9基因均未发生突变。最后,该CRISPR系统还应用于其他大肠杆菌实验室菌株和产肠毒素K88菌株,并表现出高效的杀菌作用。我们设计了一种基于CRISPR/Cas9核酸酶的新型抗菌剂,为抗菌剂的研发提供新策略。     

CRISPR/Cas9系统介导的棉花GhNAC3基因编辑

为创制棉花耐旱种质资源，解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率，研究依据CRISPR/Cas9编辑原理，对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh＿D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点，并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列，排除非特异性编辑，将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接，通过2次PCR扩增，得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒，再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上，获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体，利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T₀代转基因幼苗，通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系。对T₀代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析，鉴定GhNAC3编辑类型。结果发现，CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株，经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系，从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析，发现7株在靶点区域发生编辑，编辑类型主要为碱基片段缺...     

基于CRISPR/Cas9系统筛选猪流行性腹泻病毒复制相关基因及其验证

【背景】成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9)已被广泛证实是高效、强大的第三代基因编辑工具,在发现功能基因等领域取得了重要进展,但至今尚无利用该方法挖掘猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)宿主基因的报道。【目的】利用CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因,并进行候选基因的初步验证,为培育抗PEDV种猪提供科学参考。【方法】通过CRISPR/Cas9技术构建人肝癌细胞系(Huh-7)全基因组敲除文库,利用PEDV感染Huh-7文库细胞,随后经过高通量测序筛选影响PEDV复制的关键宿主因子,结合基因干扰和检测病毒效价等相关试验对影响PEDV复制的候选基因进行初步验证。【结果】构建了CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因的方法,将富集程度排名靠前的整合素α11(integrin α11,ITGA11)、哺乳动物复制蛋白A2(replication protein A2,RPA2)、驱动蛋白家族成员2A(kinesin family member 2A,KIF2A)、诱导髓系白血病细胞分化蛋白1(induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1,MCL1)、多聚ADP核糖化酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]和囊泡单胺转运蛋白(vesicular monoamine transporter,SLC18A1)基因进行了验证;采用siRNA对上述基因分别进行干扰后,结果与对照组相比,干扰ITGA11可显著降低PEDV猪源靶向细胞IPEC-J2中PEDV-NmRNA、蛋白表达水平及子代病毒滴度。【结论】基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除文库可作为挖掘PEDV复制相关功能基因的有效工具,ITGA11基因可作为一种制备抗PEDV猪种潜在的靶基因。     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列,并构建Cas9-MAD2L1载体,将该载体转染到NIH/3T3细胞中,通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后,提取细胞转染后的基因组DNA,利用PCR方法,结合T7E1分析和桑格尔测序,鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况,并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞,PCR结合T7E1结果显示,以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物,可被酶切成166 bp和62 bp片段,测序结果显示,成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑,脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系,设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

一种高效无选择标记的黑曲霉基因组编辑方法

黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业生产菌株,被广泛地应用于生产酶制剂和有机酸,但仍需要进行基因组改造提高它的应用潜力。CRISPR/Cas9技术是一种被广泛采用的黑曲霉基因组编辑技术,但由于需要在基因组中整合选择标记或基因编辑效率还有待提高,影响了其在工业菌株改造中的应用。本研究建立了一种基于CRISPR/Cas9技术的高效无选择标记的基因编辑方法。首先,利用5S rRNA启动子启动sgRNA的表达,构建了一个含有AMA1(autonomously maintained in Aspergillus)复制起始片段的sgRNA和Cas9共表达质粒;同时通过敲除kusA基因构建非同源末端连接(non-homologous end joining pathway,NHEJ)修复缺陷的高效同源重组菌株;最后利用含有AMA1片段质粒的不稳定性,通过无抗平板传代丢失含有sgRNA和Cas9共表达质粒。利用该方法,在采用同源臂长度仅为20bp的无选择标记供体DNA进行基因编辑时,基因编辑效率可达到100%。该方法为黑曲霉基因功能的研究和细胞工厂的构建奠定了基础。     

原始小球藻AP2转录因子的生物信息学分析

为了揭示原始小球藻AP2基因家族编码蛋白的理化特性、分子功能和遗传进化特征,该文对原始小球藻AP2基因家族的蛋白成员进行了详细的生物信息学预测和分析,并利用PrtoParam、Pfam 3.20、Protscale等在线工具分析了原始小球藻AP2家族所包含的8个蛋白成员。结果表明:该家族成员含有的氨基酸数为247(XP_011395646.1)到715(XP_011401904.1),理论等电点最大为9.39(XP_011396011.1)、最小为5.81(XP_011398158.1); 家族中各个成员所含有的保守结构域的位置和数量都各不相同; 所有蛋白成员均无信号肽,均不包含跨膜螺旋,不具有跨膜区域; 蛋白成员中最大亲水性值为-3.222(XP_011398158.1),最大疏水性值为2.333(XP_011401904.1),且所有成员的平均亲疏水性值均小于0; 成员中有多个磷酸化位点值远超标准值0.5,最大磷酸化位点值为0.998; 该基因家族的蛋白成员二级结构的组分含量从大到小排序均为无规则卷曲>α-螺旋>延伸链>β-转角,推测α-螺旋和无规则卷曲是其二级结构的主要方式,延伸链和β-转角则分散在所有蛋白成员的氨基酸链中; 所有成员的三级结构分析中均能观察到α-螺旋、β-折叠、β-转角以及N端和C端; 系统进化分析结果表明,在其余15个物种中,与原始小球藻亲缘关系最远的是金牛介球菌(Ostreococcus tauri),亲缘关系最接近的是小球藻(Chlorella variabilis NC64A)和螺旋孢子虫(Helicosporidium),较接近的是苦参3号(Picochlorum sp. SENEW3)。该研究较系统地分析了原始小球藻AP2蛋白家族的理化特性、保守基序及系统进化关系,为进一步研究原始小球藻AP2转录因子功能和互作关系提供一定参考依据。     

地黄C3H基因的克隆及生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶属于植物中最大的蛋白酶细胞色素P450家族之一,在植物生命活动中发挥着重要作用。为了解地黄香豆酸-3-羟化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能,该研究基于地黄代谢组学分析获得KEGG途径中的C3H,采用多重比对在NCBI中获得同源基因的一个保守序列,并基于该保守序列和地黄SRA数据库,采用电子克隆和RT-PCR克隆技术获得地黄C3H基因全长CDS(RgC3H),对其进行生物信息学分析。结果表明:RgC3H基因全长为1 530 bp,且编码一个含509个氨基酸、分子量为57.91 kD、无信号肽的蛋白质; 基于氨基酸序列的结构分析显示,RgC3H有一个保守区域-P450结构域; 系统进化分析结果显示,RgC3H与芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述结果为进一步研究RgC3H基因在地黄毛蕊花糖苷生物合成途径中的作用奠定了基础。     

SNF2家族新成员Ercc6l的cDNA克隆与表达分析(英)

SNF2家族蛋白在基因组复制、修复与表达中具有重要作用. 报道了SNF2家族新成员Ercc6l (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 6-like)的cDNA克隆、特性与表达分析.通过表达序列标签（EST）搜索和组装,获得了cDNA全长4 002 bp的新基因Ercc6l(GenBank Acc.No AY172688),然后通过RT-PCR在小鼠胚胎心脏成功克隆了该基因.Ercc6l在小鼠基因组中由两个外显子和一个内含子组成,定位于X染色体,最大开放阅读框（ORF）编码一个含1 240个氨基酸的假定蛋白质.该假定蛋白质含有SNF2蛋白的8个保守基序（SNF2结构域）.通过与SNF2家族各亚家族的成员进行多重比对,初步确认Ercc6l属于ERCC6亚家族成员.将Ercc6l编码区克隆到pEGFP-C3然后转染HeLa,3T3 和B16细胞,融合蛋白主要定位于胞浆.BLAST搜索检索出69条小鼠EST与Ercc6l同源,这些EST主要来自胚胎和肿瘤组织.对小鼠不同发育时期的多种组织进行RT-PCR,发现Ercc6l在胚胎期强表达,出生产后表达显著下调.这些结果提示Ercc6l在胚胎发育和肿瘤发生中可能具有重要作用.     

多靶点CRISPR表达载体系统的设计和构建

CRISPR/Cas9核酸酶系统能实现多基因的高效靶向编辑,但是多靶点CRISPR表达载体的构建比较复杂。本研究以细菌的DNA旋转酶和二氢叶酸还原酶为靶基因,选择多个打靶位点,合成携带靶序列和多克隆位点的寡聚核苷酸引物,直接退火延伸合成靶序列DNA,利用同尾酶产生相同粘性末端的特点,将靶序列克隆至骨架载体,然后依次加入更多靶序列,实现多靶点的串联。最后测序验证,单靶点、双靶点和三靶点成功插入CRISPR表达载体,同时保留了多克隆位点,实现多靶点串联。本研究设计的多靶点CRISPR表达载体系统操作简单、成本低、成功率高,为后续细菌多基因编辑提供技术支撑,同时可拓展应用于其他生物多基因打靶研究。     

黄毛草莓FnMYB24转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

该研究以黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl.)为材料,采用RT PCR技术克隆了黄毛草莓FnMYB24基因的cDNA和启动子序列。生物信息学分析表明,FnMYB24的cDNA序列长为1 033 bp(GenBank登录号为MN879283),其开放阅读框(ORF)长为609 bp,编码202个氨基酸,含有1个保守的MYB_DNA binding结构域。同源分析结果显示,黄毛草莓FnMYB24基因编码的氨基酸序列与森林草莓(Fragaria vesca)编码的氨基酸相似性较高;同时进一步克隆了该基因编码起始位点上游长度为718 bp启动子序列(GenBank登录号为MN879285),预测该序列包含激素响应元件、光调控元件等多个顺式作用元件。通过构建pFnMYB24∷GUS表达载体进行烟草瞬时转化,发现pFnMYB24启动子具有转录活性且能够驱动FnMYB24基因表达。实时荧光定量PCR结果显示：抗病品种黄毛草莓和易感病栽培品种‘妙香3号’的叶片接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后MYB24基因表达量均有上调,但‘妙香3号’的MYB24表达量始终低于黄毛草莓的表达量;SA处理后2个草莓品种的MYB24表达量均高于对照组,表明MYB24基因受水杨酸(SA)的诱导表达。研究表明,草莓MYB24基因可能参与调控抗炭疽病,为进一步研究MYB24基因在草莓抗炭疽病中的功能奠定了基础。     

苹果属垂丝海棠MhPPOX1基因克隆及抗缺铁性功能鉴定

原卟啉原氧化酶(Protoporphyrinogen oxidase, PPOX1) 是叶绿素生物合成途径中的关键酶,为深入探究苹果PPOX1基因的功能,该研究以苹果砧木垂丝海棠(Malus halliana)为试材,采用PCR方法,克隆MhPPOX1基因,并进行生物信息学分析及功能鉴定;采用农杆菌介导法转化烟草和拟南芥,进一步分析MhPPOX1在缺铁胁迫中的功能,并对转基因烟草与拟南芥进行抗性分析。结果表明：(1)成功克隆获得 垂丝海棠MhPPOX1基因片段,经序列比对鉴定为苹果的 MhPPOX1基因(序列号：LOC103444480)。MhPPOX1基因的开放阅读框为1 644 bp,编码547个氨基酸,等电点为8.98;系统进化树分析表明,苹果属垂丝海棠MhPPOX1与白梨该家族蛋白的亲缘关系最近。(2)成功克隆获得垂丝海棠MhPPOX1启动子序列片段(2 016 bp),对该启动子顺式作用元件预测结果显示,MhPPOX1启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素以及与叶绿素相关等响应元件。(3)成功构建过表达载体 MhPPOX1 pRI101,并成功获得转MhPPOX1基因烟草和拟南芥。(4)qRT PCR分析表明,垂丝海棠幼苗在缺铁( Fe)胁迫下植株叶片黄化枯死,且MhPPOX1基因表达量较对照显著升高;转MhPPOX1基因烟草和拟南芥在缺铁胁迫中与野生型相比均生长良好,不易黄化,且缺铁条件下转基因拟南芥和烟草的叶绿素a、叶绿素b总量以及总铁含量明显高于野生型植株,表明MhPPOX1基因过量表达提高了拟南芥和烟草对缺铁胁迫的抗性。研究认为,MhPPOX1基因在植物抵抗缺铁胁迫中可能发挥重要作用。