甲型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞核酸增殖培养模型的建立

目的采用人胚肺二倍体细胞(2BS细胞)培养,结合实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测,开展甲型肝炎病毒(HAV)在2BS细胞核酸增殖培养模型的建立研究。方法将不同浓度的HAV活病毒感染2BS细胞,分别于感染后0、8、10、14、20 d收获HAV感染的细胞,应用已建立的HAV核酸检测和抗原检测方法分别检测HAV病毒核酸含量和抗原含量的动态变化。结果 HAV在2BS细胞中可有效复制和扩增,高剂量组以1×10~4 CCID_(50)/mL HAV感染0 d即可检测到HAV核酸,10～20 d病毒核酸达到峰值7.607 lg copies/μL;中剂量组以1×10~2 CCID_(50)/mL HAV感染6 d可检测到HAV核酸,6～10 d病毒增殖明显(P0.05),14～20 d病毒核酸含量达到峰值7.074 lg copies/μL并趋于稳定;而低剂量组以1 CCID_(50)/mL HAV感染后,10 d HAV开始增殖,20 d病毒核酸含量与中、高剂量组别相近且基本达到峰值;当HAV感染2BS细胞10 d时,病毒核酸检出拷贝数与感染HAV浓度呈良好的线性关系,可根据标准曲线准确反映样品中的HAV活病毒含量。细胞培养结合病毒抗原表达也可有效反映HAV的扩增情况,但较病毒核酸的出现呈明显滞后,且当样品中抗原含量低时,至少需要20 d以上才可完全检测到病毒抗原的表达。结论应用2BS细胞培养和qRT-PCR检测建立了2BS细胞HAV核酸增殖模型,可快速、准确地反映HAV活病毒在细胞中的动态感染和增殖情况,可应用于HAV活病毒的快速定量、病毒特性、药物筛选和疫苗评价等相关研究。     

一种甲型肝炎灭活疫苗灭活验证试验方法的建立

目的探讨细胞培养/链特异性RT-PCR方法可否作为甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(L-A-1减毒株)的病毒灭活验证试验方法。方法根据甲肝病毒(HAV)L-A-1株基因组序列,设计5条基因特异性引物,提取HAV基因组RNA,应用设计的正向引物进行反转录,再进行两轮PCR扩增,通过检测HAV复制过程中的负链中间体,对甲肝灭活疫苗灭活验证试验方法进行探讨,并与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验方法进行比较。结果细胞培养/链特异性RT-PCR方法对HAV负链RNA特异、敏感。通过方法学验证试验表明,该方法的特异性、敏感性和重复性均良好。利用此方法对5批甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)进行检测,结果全为阴性,与《中华人民共和国药典》甲肝灭活疫苗HAV灭活验证试验测定结果相同。结论细胞培养/链特异性RT-PCR方法快速、灵敏可靠,可作为检测甲肝灭活疫苗(L-A-1减毒株)HAV灭活验证试验的方法。     

小鹅瘟病毒纯化及其理化特性的研究

详细描述了小鹅瘟病毒(Goslin—plague virus,GPV)扬州株的浓缩和纯化过程,并论述了其理化特性。试验证明,GPV在氯化铯中主要病毒区带的浮密度为11.31～1.35g/ml,电镜下可见空壳和实心两种病毒粒子,大小20～22nm,沉降系数90.5S。用Sepharose 4B柱层析纯化的病毒,等电点为4.3。GPV有3种结构多肽,即Vp1、Vp2和Vp3,分子量分别为85 000,61 000,57 500道尔顿,其中Vp3为主要结构多肽,纯化的病毒粒子能使鹅胚致死。     

衣原体噬菌体衣壳蛋白3的结构、免疫原性及临床价值研究

分析衣原体微病毒Vp3蛋白在分子重组、分子进化及病毒野生株筛查的作用并挖掘生物信息,揭示其临床研究价值。以ProteinBlast的Multriple alignment程序比对各株衣原体微病毒衣壳蛋白Vp3序列;以Distance tree(ProteinBlast)程序完成种系发生树。以比对获得的高保守区的氨基酸序列为目标,应用Karplus-schulz法进行柔性区域分析;通过Gamier-robson法和Chou-fasman法分析该序列的二级结构;使用Emini法完成表位的表面可及性分析,并用Kyte-Doolittle法和Hopp-woods法完成蛋白亲水性研究;应用Jameson-Wolf法完成表位的抗原指数分析。6株衣原体微病毒Vp3蛋白序列高度保守,差异主要在Chp1与其他5株微病毒的Vp3蛋白之间。各株微病毒的Vp3蛋白均有以α螺旋为主的结构,蛋白序列高保守区存在多个细胞表位。Vp3蛋白结构性质保守,也是衣原体噬菌体衣壳的重要组分。其蛋白分子结构复杂,高保守区有较强的免疫原性,在分子重组、沙眼衣原体微病毒野生株筛查研究中有实际研究价值。     

封面说明

正封面图片呈现的是利用高分辨X射线衍射技术获得、分辨率为0.3 nm的甲型肝炎病毒(Hep atitis A Virus,HAV)结构图。该项研究不仅揭示了甲肝病毒独有的结构特性,而且从三维结构角度阐述了HAV的进化关系与起源。目前全球每年有140万HAV感染的病例,因此该研究成果对进     

表达甲型肝炎病毒抗原的重组痘苗病毒(VMS11 HAV25)的免疫原性

甲型肝炎(甲肝)病毒基因全部开放读码框架cDNA重组于痘苗病毒天坛株DNA的HindⅢM片段,获得了重组痘苗病毒VMS11HAV25。用10~7PFU或10~8PFU病毒量皮内免疫家兔,能诱生甲肝病毒抗体,其滴度与免疫剂量、免疫次数及间隔有关。组织培养中和试验表明,该抗体具有中和甲肝病毒的能力。VMS11HAV25的免疫效果似优于本实验室已报道的另一株甲肝病毒基因重组于TK区的重组痘苗病毒Re41。     

甲肝病毒（龙甲—25株）在Frhk4细胞上传代特征

应用Frhk4细胞增殖HAV,经较系统研究,建立了稳定的细胞传代方法,病毒增殖条件,获得了较大量的甲肝病毒抗原.HAV龙甲-25株在2BS细胞上传至第六代移到Frh4细胞上连续传至九代,用荧光法(IF)、EMISA夹心法,和免疫电镜方法(IEM)进行检测,结果表明龙甲-25不同代次间的病毒增殖情况不同.我们将龙甲-25HAV在Frhk4细胞上从第七代传至第十六代,分别用IF,ELISA,IEM方法检测,结果是细胞在感染病毒后不同天数的IF结果阳性,病毒传代的代次不同在ELISA和IEM检测中出现不同的结果.在第九代至第十一代的HAV′培养过程中我们改变了病毒培养及收获方法,再重复试验时,出现三种实验方法一致的结果.     

甲型肝炎病毒抗原蛋白的制备与分析

目的提取并制备甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)抗原蛋白,了解、分析其主要成分和性质。方法利用人胚肺二倍体细胞培养并收获HAV,释放并初步提取病毒抗原;采用阴离子交换层析和分子筛层析等方法纯化制备HAV抗原蛋白;再利用凝胶电泳(gel electrophoresis)和Western印迹法(Western Blot)对蛋白成分和性质进行分析。结果初步提取的HAV抗原回收率为87.50%,蛋白质去除率为87.88%。纯化后的HAV抗原蛋白的电泳显示HAV抗原蛋白主要由3条蛋白带组成,相对分子质量分别为33 000、29 000和25 000;Western Blot结果显示,相对分子质量为33 000和29 000的2条蛋白带可与抗体反应。结论实验提取并制备了HAV抗原蛋白,其电泳条带的相对分子质量与HAV衣壳蛋白VP1、VP3和VP2的相对分子质量相当,其中两条蛋白带可与抗体发生免疫反应,含有主要的抗原表位。     

甲肝病毒在人血白细胞中体外连续传代和在分类白细胞中增殖的研究

1985年我们采用间接免疫荧光法(IF法)检测出甲肝患者外周血白细胞中有甲肝抗原(HAAg)存在,继而又将HAAg阳性白细胞直接种入PLC/PRF/5细胞,分离到两株甲肝病毒(HAV)NJ—3株和H—1株。为了弄清白细胞所携带的病毒究竟仅为吸附吞饮,抑或能在其中复制增殖,我们将分离到的HAV用正常人血白细胞进行体外增殖试验,现将结果报告如下。     

阴离子交换色谱纯化甲型肝炎病毒(YN5株)的研究

对阴离子交换色谱纯化HAV的合适条件进行了探索。先使用“试管法”研究DEAE Sepharose Fast Flow凝胶结合HAV及病毒解离的条件,然后分别使用线性阶段洗脱和阶段梯度洗脱在柱色谱上进行了HAV的纯化。结果表明经过阴离子交换色谱纯化得到的病毒保持有抗原性和免疫原性,HAV抗原回收率大于85％,杂蛋白去除率大于80％,纯化的病毒样品中的内毒素与宿主DNA的含量也大大降低,证明阴离子交换色谱可用于HAV疫苗的纯化。