美满霉素对癫痫大鼠海马神经元凋亡的影响

目的探讨美满霉素(minocycline,MC)对癫痫模型大鼠海马神经元的抗凋亡保护作用。方法将大鼠随机分为3组:生理盐水对照组(NS组),海人酸致痫组(KA组)和美满霉素预处理+海人酸组(MC+KA组)。以免疫组化法检测各组大鼠造模后2h、8h和24h海马部位Cytochrome C(CytC)免疫反应性。采用半定量RT-PCR和免疫组化法检测24h、48h caspase-3 mRNA和caspase-3表达情况。结果在KA致痫后2hCytC即开始有表达,8h达到高峰,24h表达减少,而MC预处理明显减弱此效应。caspase-3 mRNA的含量及caspase-3免疫反应性在24h时间点三组之间无明显差异,在48h时间点,KA组明显高于对照组(P0.05),MC预处理则明显拮抗KA诱导的caspase-3高表达。结论 KA致痫能诱导大鼠海马神经元凋亡,而MC能通过抑制凋亡途径对海马神经元发挥神经保护作用。     

超声刺激在红藻氨酸诱导的癫痫小鼠中呈现抗癫痫和海马神经保护作用

目的研究超声刺激(ultrasound stimulation, US)在红藻氨酸(kainate, KA)诱导的小鼠癫痫模型中的抗癫痫作用。方法将小鼠随机分为对照组(n=11)、KA组(n=12)和KA+US组(n=12)。通过侧脑室注射KA建立小鼠癫痫模型,并给予US处理2周。通过视频监控记录US对KA诱发的小鼠癫痫相关行为的影响;通过脑电图检测US对小鼠癫痫发作时的脑电活动的影响;通过尼氏染色观察US对海马CA3区神经元大体形态和密度的影响;通过FJB与NeuN共定位观察US对海马CA3区神经元退化变性的影响;通过GFAP免疫组织化学染色观察US对海马CA3区星形胶质细胞活化增生的影响。结果 US可显著减少KA处理后小鼠癫痫发作次数并延长癫痫发作潜伏期。脑电图记录结果显示,US可显著降低棘波频率。尼氏染色显示,KA组海马CA3区神经元呈现核固缩且神经元密度降低;相对于KA组,KA+US组海马CA3区神经元核固缩明显减少,神经元密度明显增加。FBJ和NeuN共定位染色显示,US可显著降低KA引起的海马CA3区神经元退化变性。GFAP免疫组织化学染色显示,KA组海马CA3区星形胶质细胞明显增多,而US可减少其数量。结论 US具有抗癫痫作用,且这一作用可能与其抑制海马CA3区的神经元退化并降低星形胶质细胞活化增生相关。     

褪黑素对海人酸致痫大鼠海马内TGF-β3水平的影响

目的探讨褪黑素(me1atonin,MT)对海人酸(kainic acid,KA)致痫大鼠海马内TGF-β3的影响,进一步明确其在中枢内的作用。方法将实验大鼠随机分为3组:生理盐水对照组(NS组)、海人酸组(KA组)、褪黑素+海人酸组(MT+KA组)。各组大鼠给予相应试剂处理后观察并记录大鼠行为学改变,用免疫组织化学方法、RT-PCR检测大鼠海马内TGF-β3(transforming growth factor-β3)的表达情况及其mRNA变化。结果动物行为学观察显示,NS组无癫痫发作,KA组发作程度为Ⅲ-V级,MT+KA组为0-Ⅲ级;免疫组织化学结果显示,TGF-β3在3组大鼠海马内均有表达,其中KA组、MT+KA组较NS组表达增强,MT+KA组较KA组增强,差异具有显著性意义(P0.05);RT-PCR结果显示,与NS组相比较,KA组、MT+KA组大鼠海马内TGF-β3 mRNA含量均升高;但MT+KA组升高较KA组多,差异具有显著性意义(P0.05)。结论褪黑素能明显改善海人酸诱发的大鼠癫痫,增强海马内TGF-β3的表达,减轻海马神经元损伤,发挥中枢保护作用。     

雌激素受体α抑制剂MPP在小鼠囊胚形成和滋养层干细胞中影响YAP核定位

目的研究雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)抑制剂甲基-哌啶-吡唑(methyl-piperidino-pyrazole,MPP)在小鼠桑葚胚和滋养层干细胞(trophoblast stem cells,TSCs)中对YAP的影响。方法收集昆明(kunming,KM)小鼠8-细胞胚,置于0μmol/L(对照组)和5μmol/L(实验组)MPP中培养,分别于8h、12h和24h后收集各组桑葚胚,采用免疫荧光技术观察YAP表达,采用Real Time-PCR检测MPP处理24h后Yap mRNA表达变化;将小鼠TSCs置于0μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L MPP中培养,48h后观察细胞形态改变,分别检测Sox2、YAP、Cdx2 mRNA和蛋白表达水平。结果小鼠8-细胞胚经MPP处理24h后,桑葚胚YAP蛋白核定位水平降低,Yap mRNA水平无显著改变;经MPP处理48h后,5μmol/L组小鼠TSCs细胞出现细胞团块,10μmol/L组细胞增殖明显受抑制;与对照组相比,5μmol/L组细胞Sox2 mRNA表达水平升高,Yap和Cdx2 mRNA水平无显著改变,团块状细胞中的YAP蛋白失去明显的核内定位,SOX2和CDX2阳性细胞的表达更加密集。结论 ERα在小鼠桑葚胚和TSCs中调控YAP核定位,其在TSCs细胞中的作用与CDX2和SOX2的表达有关。     

杏仁核注射红藻氨酸诱导大鼠边缘叶癫痫发作时海马中Smac和XIAP蛋白的表达

应用红藻氨酸(kainic acid,KA)诱导的大鼠边缘叶癫痫发作模型,检测第二个线粒体源的半胱天冬蛋白酶激活物,直接与凋亡抑制蛋白结合的低等电点蛋白(second mitochondrial activator of caspases／direct inhibitor of apoptosis protein-binding protein of low isoelectric point[PI],Smac／DIABLO)和X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)在癫痫大鼠海马神经元表达。单侧杏仁核内注射KA诱导癫痫发作,1h后用安定终止发作,然后分别用TUNEL染色和cresyl violet染色观察海马神经元存活和凋亡的变化,用免疫荧光和Western blot检测海马Smac／DIABLO、XIAP和半胱天冬蛋白酶-9(caspase-9)的表达。结果表明,发作终止2h时KA注射同侧海马CA3区细胞浆内Smac／DIABLO蛋白表达增加,4h时caspase-9出现裂解片断,8h时出现TUNEL阳性细胞,24h时达高峰。脑室内注射caspase-9抑制剂z-LEHD-fluoromethyl ketone(z-LEHD-fmk)可减少TUNEL阳性细胞,增加存活神经元。发作后KA注射同侧海马CA3区神经元caspase-9免疫反应性增强,Smac／DIABLO和XIAP弥散于整个神经元内。对侧海马未检测到TUNEL阳性细胞及Smac／DIABLO和XIAP蛋白的上述变化。以上结果提示,癫痫发作可诱导Smac／DIABLO蛋白从线粒体向细胞浆的移位、XIAP亚细胞分布改变和caspase-9的激活,Smac／DIABLO、XIAP和caspase-9可能参与了癫痫神经元损伤的病理生理机制,caspase-9可能是潜在的治疗靶点。     

小胶质细胞活化对癫痫发病的影响

目的探讨抑制小胶质细胞活化对癫痫发作的影响及对脑神经元的保护作用。方法将大鼠随机分为4组：生理盐水对照组（NS组）,海人酸致痫组（KA组）,美满霉素预处理＋海人酸组（MC＋KA组）,单纯美满霉素组（MC组）。采用免疫组化法观察各组大鼠造模后脑内Ox-42、c—fos和caspase-3免疫反应性。RT—PCR或Westernblot法检测造模后Apaf-1mRNA含量和caspase-3蛋白表达量。结果在KA致痫后2h大脑皮质及海马部位有明显的小胶质细胞活化、增殖,同时C—los蛋白的表达在致痫组也较对照组显著增强,Mc干预致痫组可明显减弱上述效应。Apaf-1mRNA的含量及caspase-3蛋白含量和免疫反应在造模后24h时间点四组之间无明显差异,在48h和72h时间点,KA组明显高于对照组（P〈0．05）,MC预处理则明显拮抗其高表达（P〈O．05）。结论KA致痫不仅通过提高神经元的兴奋性而且也通过激活小胶质细胞共同导致癫痫发作,二者相互协同作用,可进一步促进神经元凋亡,而MC能通过抑制小胶质细胞活化在癫痫中发挥神经保护作用。     

谷氨酸下调培养海马神经元AMPA 受体GluR2亚单位的表达

目的研究在癫痫发病过程中,谷氨酸对AMPA受体Glu R2亚单位表达变化的影响。方法用RT-PCR和Western Blot方法观察谷氨酸诱导培养大鼠海马神经元AMPA受体Glu R2亚单位mRNA和蛋白的表达变化。结果在谷氨酸刺激后2h,8h,12h,培养海马神经元Glu R2mRNA和蛋白表达明显下降,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05),而非NMDA受体拮抗剂CNQX能阻断此变化。结论在癫痫等疾病中,谷氨酸能通过激活AMAP/KA受体下调AMPA受体GluR2亚单位的表达,参与发病过程。     

蝎毒耐热蛋白对红藻氨酸诱导的海马NPY能神经元损伤的影响

目的:观察蝎毒耐热蛋白(SVHRP)对红藻氨酸(KA)诱导的原代培养海马神经肽Y(NPY)能神经元损伤的影响及其可能的分子机制。方法:制备原代培养10d的大鼠海马神经元并用神经元特异性MAP-2抗体进行鉴定,将鉴定成熟的神经元用终浓度为20μg/ml的SVHRP和10μmol/L的KA处理,共孵育24h后,分别用硫堇染色、MTT实验检测不同给药组残存神经元的数目和活力,用免疫细胞化学和RT-PCR技术检测NPY-IR和NPYmRNA的表达。结果:MAP-2-IR结果显示85%以上为阳性成熟神经元;硫堇染色显示,同模型组比较,模型给药组未见神经元形态异常,并且神经元数目未见明显减少(P<0.05);MTT实验显示,模型给药组海马神经元存活率较模型组明显增高(P<0.05);NPY-IR检测表明,模型组NPY阳性细神经元数目明显减少,模型给药组NPY阳性神经元数目明显多于模型组(P<0.01);RT-PCR实验表明,单独给药组海马神经元内NPYmRNA表达较其他三组明显增多(P<0.05)。结论:SVHRP对KA诱导的原代海马神经元的兴奋毒性损伤具有明显的保护作用,可能与SVHRP促进NPY合成有关。     

海仁酸致痫大鼠海马组织AMPA受体GluR2表达的变化

目的　为了研究AMPA受体在癫痫发生中的作用。方法　本研究用免疫组织化学方法观察了海仁酸致痫大鼠海马组织AMPA GluR2受体的表达变化。结果　在侧脑室注射海仁酸后 1h ,4h ,12h ,2 4h及 7d ,大鼠海马CA3区及齿状回GluR2的表达明显减弱 ,显微图像分析 :与对照组相比 ,KA 4h ,KA 12h ,KA 2 4h ,KA 7d组大鼠海马组织GluR2阳性神经元平均光密度值降低 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论　在癫痫发作过程中AMPA受体 GluR2亚单位表达改变可能与癫痫发作导致的神经元损伤有密切关系。     

锌对体外应激海马神经元MTs亚型表达的影响

目的:观察不同锌水平对体外应激海马神经元金属硫蛋白(MTs)亚型表达的影响。方法:取新生1dWis-tar大鼠海马组织进行体外神经元培养,无血清培养24h后,分别向培养液中加入皮质酮、Zn2+特异鳌合剂TPEN,使二者的最终浓度均为1×10-5mol/L,然后加入不同浓度的ZnSO4溶液,使Zn2+的最终浓度分别为1×10-5mol/L、1×10-4mol/L和2×10-4mol/L,作用24h后检测培养液中IL-6和NO含量,以蛋白印迹法检测细胞MTs含量,以RT-PCR检测细胞MT-1mRNA和MT-3mRNA的表达水平。结果:在海马神经元培养液中加入TPEN后,MTs的表达出现明显降低,皮质酮刺激也未见其表达升高。在补锌组,MTs的含量均明显增加,其中以10-4mol/LZn2+组的表达量最高。海马神经元MT-1mRNA和MT-3mRNA的表达水平在皮质酮应激组和补锌组均出现明显升高。另外,锌缺乏和皮质酮刺激可使海马神经元培养上清中的IL-6和NO水平均出现明显升高。结论:不同锌水平对应激海马神经元金属硫蛋白及其亚型mRNA的表达具有调控作用,缺锌可降低金属硫蛋白的表达,而补锌可增加金属硫蛋白的表达。     

LncRNA-UCA1 inhibits the astrocyte activation in the temporal lobe epilepsy via regulating the JAK/STAT signaling pathway

This article aimed to reveal the mechanism of long noncoding RNA (lncRNA) urothelial cancer-associated 1 (UCA1) regulated astrocyte activation in temporal lobe epilepsy (TLE) rats via mediating the activation of the JAK/STAT signaling pathway. A model of TLE was established based on rats via kainic acid (KA) injection. All rats were divided into the Sham group (without any treatments), KA group, normal control (NC; injection with empty vector) + KA group, and UCA1 + KA group. The Morris water maze was used to test the learning and memory ability of rats, and the expression of UCA1 in the hippocampus was determined by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Surviving neurons were counted by Nissl staining, and expression levels of glial cells glial fibrillary acidic protein (GFAP), p-JAK1, and p-STAT3 and glutamate/aspartate transporter (GLAST) were analyzed by immunofluorescence and Western blot analysis. A rat model of TLE was established by intraperitoneal injection of KA. qRT-PCR and fluorescence analyses showed that UCA1 inhibited astrocyte activation in the hippocampus of epileptic rats. Meanwhile, the Morris water maze analysis indicated that UCA1 improved the learning and memory in epilepsy rats. Moreover, the Nissl staining showed that UCA1 might have a protective effect on neuronal injury induced by KA injection. Furthermore, the immunofluorescence and Western blot analysis revealed that the overexpression of UCA1 inhibited KA-induced abnormal elevation of GLAST, astrocyte activation of the JAK/STAT signaling pathway, as well as hippocampus of epilepsy rats. UCA1 inhibited hippocampal astrocyte activation and JAK/STAT/GLAST expression in TLE rats and improved the adverse reactions caused by epilepsy.     

Effect of intranasal and oral administration of levetiracetam on the temporal and spatial distributions of SV2A in the KA-induced rat model of SE

To investigate the effectiveness of nasal delivery of levetiracetam (LEV) on the distributions of synaptic vesicle protein 2 isoform A (SV2A) in epileptic rats with injection of kainic acid (KA) into amygdala. A total of 138 rats were randomly divided into four groups, including the Sham surgery group, the epilepsy group (EP), and the LEV oral administration (LPO) and nasal delivery (LND) groups. The rat intra-amygdala KA model of epilepsy was constructed. Pathological changes of rat brain tissue after status epilepticus (SE) were detected using haematoxylin and eosin staining. Expression of SV2A in rat hippocampus after SE was evaluated using the western blotting analysis. Expression and distribution of SV2A in rat hippocampus after SE were detected based on immunofluorescence staining. The EP group showed evident cell loss and tissue necrosis in the CA3 area of hippocampus, whereas the tissue damage in both LPO and LND groups was significantly reduced. Western blotting analysis showed that the expressions of SV2A in the hippocampus of both EP and LND groups were significantly decreased 1 week after SE, increased to the similar levels of the Sham group in 2 weeks, and continuously increased 4 weeks after SE to the level significantly higher than that of the Sham group. Results of immunofluorescence revealed largely the same expression patterns of SV2A in the CA3 area of hippocampus as those in the entire hippocampus. Our study revealed the same antiepileptic and neuronal protective effects by the nasal and oral administrations of LEV, without changing the expression level of SV2A.     

局部高频电刺激海马对海人酸致痫大鼠海马细胞外谷氨酸和γ-氨基丁酸释放的影响

目的：通过高频电刺激海人酸癫痫模型大鼠海马,观察海马细胞外谷氨酸（Glu）和γ-氨基丁酸（GABA）的动态变化。方法：将SD大鼠分成4大组（n=10）：①空白组;②海人酸组;③假刺激组：植入刺激电极未予电刺激;④电刺激组：海人酸注射后予130 Hz电刺激。利用微透析技术收集不同时段海马细胞外液,应用高效液相-荧光检测法测定收集液Glu、GABA的浓度。结果：注射海人酸后Glu明显升高,并持续至第14天,电刺激使Glu明显下降;而注射海人酸后GABA呈短暂性升高,后逐渐下降于第4天后保持稍高于正常水平,电刺激并无明显改变GABA的水平。结论：海马细胞外Glu下降在海马电刺激治疗癫痫中起到重要作用;高频电刺激海马选择性地减少谷氨酸能神经元活动,但不影响GABA的释放。     

TRP 对KA 诱导的AD 模型大鼠学习记忆的影响及其作用机制

目的:观察雷公藤甲素(Triptolide,TRP)对海人藻酸(Kainic acid,KA)海马内注射后大鼠学习记忆的影响及其作用机制。方法:采用Morris水迷宫筛选空间学习记忆能力正常的SD雄性大鼠90只(200～220g)。将实验动物分成3组:右侧海马注射生理盐水后生理盐水灌胃对照组(NS+NS)、右侧海马注射海人藻酸后生理盐水灌胃干预组(KA+NS)、右侧海马注射海人藻酸后雷公藤甲素灌胃干预组(KA+TRP)。动物存活1天,3天,5天,7天,14天,每个时间点6只,处死前分别于各相应时间点用Morris水迷宫检测各组动物空间位置记忆能力;免疫组织化学方法结合图像分析技术检测海马CA1区神经元COX-2的表达。结果:与NS组(NS+NS)比较,KA组(KA+NS)大鼠逃避潜伏期延长(P<0.05),跨越原平台次数减少(P<0.05);海马CA1区的神经元COX-2表达升高(P<0.05);TRP组(TRP+KA)与KA组比较,大鼠的平均逃避潜伏期从第5天起缩短(P<0.05),跨越原平台次数增多(P<0.05),海马CA1区神经元COX-2表达在5天,7天时下调(P<0.05)。结论:KA海马内注射,可以导致大鼠学习记忆功能障碍及上调海马CA1区神经元COX-2表达;雷公藤甲素干预治疗,能够改善动物的学习和记忆能力,能抑制KA诱导的海马CAl区神经元COX-2的表达。     

百草枯致小鼠肺间质纤维化过程中Smad3蛋白的表达

目的 使用免疫组织化学的方法观察百草枯(paraquat,PQ)致小鼠肺间质纤维化过程中Smad3蛋白的表达.方法 58只雄性C57BL/6J小鼠随机分组.实验组48只,通过腹腔注射10 mg/kg PQ建立小鼠肺间质纤维化模型,对照组10只,腹腔注射等量生理盐水.小鼠在实验组染毒后第2、5、7、14天和对照组第7天时分别被安乐死,留取肺组织标本.标本进一步进行HE染色和Smad3蛋白的免疫组化研究.结果 光镜观察小鼠染毒后第2～5天肺组织出现水肿、出血、炎症细胞浸润等改变,第7天有少量胶原沉积及斑片状的纤维化表现,第14天表现更加明显.免疫组化观察染毒小鼠肺组织Smad3蛋白表达,第2～7天肺中巨噬细胞和部分Ⅱ型肺泡上皮细胞的细胞核中见到阳性表达.Smad3阳性表达和巨噬细胞数量呈正相关.第14天,在成纤维细胞灶增生的成纤维细胞核中,也可见到Smad3弱阳性表达.结论 在PQ致肺间质纤维化过程中,Smad3蛋白异常表达并对肺纤维化的发生发展具有重要的作用.     

蝮蛇毒介导小鼠急性心肌损伤及心肌组织TNF-α表达的研究

目的探讨蝮蛇毒介导小鼠心肌组织中TNF-α蛋白表达变化与不同蝮蛇毒剂量、中毒时间的关系。方法确定LD50蝮蛇毒注射剂量。将96只小鼠随机分为空白对照组、蛇毒低剂量(0.5mg/kg)组、蛇毒高剂量(1.0mg/kg)组,并按中毒时间设4水平组,即3、6、24、48h组,采集小鼠心肌标本,免疫组化检测心肌组织中TNF-α蛋白的表达情况。结果蛇毒低剂量组及蛇毒高剂量组小鼠心肌TNF-α蛋白表达明显高于空白对照组(均P0.05);而蛇毒高剂量组明显高于低剂量组(P0.05);6h组明显高于3h组(P0.05);24h组高于6h组(P0.05);48h组高于24h组(P0.05)。随着蝮蛇毒剂量的增加、中毒时间的延长,心肌TNF-α蛋白的表达越高。结论蝮蛇毒导致小鼠急性心肌损伤,TNF-α蛋白表达增高,且随着蝮蛇毒剂量的增加、中毒时间的延长,心肌TNF-α蛋白的表达越高,呈一定的时间、剂量效应趋势,提示TNF-α蛋白过度表达可能是蝮蛇毒导致小鼠急性心肌损伤的机制之一。     

Proteolytic fragments of laminin promote excitotoxic neurodegeneration by up-regulation of the KA1 subunit of the kainate receptor

Degradation of the extracellular matrix (ECM) protein laminin contributes to excitotoxic cell death in the hippocampus, but the mechanism of this effect is unknown. To study this process, we disrupted laminin γ1 (lamγ1) expression in the hippocampus. Lamγ1 knockout (KO) and control mice had similar basal expression of kainate (KA) receptors, but the lamγ1 KO mice were resistant to KA-induced neuronal death. After KA injection, KA1 subunit levels increased in control mice but were unchanged in lamγ1 KO mice. KA1 levels in tissue plasminogen activator (tPA)–KO mice were also unchanged after KA, indicating that both tPA and laminin were necessary for KA1 up-regulation after KA injection. Infusion of plasmin-digested laminin-1 into the hippocampus of lamγ1 or tPA KO mice restored KA1 up-regulation and KA-induced neuronal degeneration. Interfering with KA1 function with a specific anti-KA1 antibody protected against KA-induced neuronal death both in vitro and in vivo. These results demonstrate a novel pathway for neurodegeneration involving proteolysis of the ECM and KA1 KA receptor subunit up-regulation.     

锂-匹罗卡品颞叶癫模型的建立及苔藓纤维出芽的动态变化

目的研究锂-匹罗卡品颞叶癫模型大鼠致后性发作的行为学特点及海马结构病理改变的动态变化。方法将所有Wistar大鼠随机分为对照组和实验组,实验组大鼠腹腔依次注射氯化锂、匹罗卡品诱发癫持续状态（SE）后,观察其自发性癫发作（SRS）,分别于SE后1周至10周5个不同时间点取材,Nissl染色和Timm染色分别观察海马神经元损伤及苔藓纤维出芽（MFS）的变化。结果注射匹罗卡品后84%的大鼠可诱发出SE,经过10～20d的缄默期后,可观察到Ⅰ～Ⅲ级的反复SRS,病理学检查可见海马神经元的损伤及齿状回内分子层MFS。结论锂-匹罗卡品颞叶癫模型与人类颞叶癫有类似发作特点及病理改变,是一种理想的颞叶癫动物模型。