人血管内皮生长因子功能域受体的筛选及其生物学活性研究

利用PCR技术,从人胎盘cDNA文库扩增出4个截短的人血管内皮生长因子受体(Flt-1)cDNA,分别含胞外第2,1-2,2-3,1-3个loop,应用酵母双杂交系统对Flt-1的最小配体结合域进行了研究,结果表明,不仅其胞外1-3loop能与hVEGF₁₆₅结合,比其更小的片段2-3loop也具有与配体结合的能力.进一步构建了重组表达质粒pPIC9K/Flt-1(1-3)和pPIC9K/Flt-1(2-3),转化Pichia pastoris酵母菌GS115,摇瓶培养,经1%甲醇诱导,表达的Flt-1以可溶性分子形式存在于上清中,诱导4 d的表达量占上清总蛋白质的60%以上.表达产物经CM-Sepharose FF阳离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析纯化,纯度达90%以上.体外生物学活性检测表明,表达的可溶性Flt-1(2-3)具有与Flt-1(1-3)接近的结合hVEGF₁₆₅的能力和抑制hVEGF₁₆₅对HUVEC的促增殖功能.进一步的动物模型实验证实,可溶性Flt-1(2-3)具有显著的抑制hVEGF₁₆₅促进新生血管形成的功能.     

改造稀有密码子提高SEA蛋白表达量

利用重叠PCR技术突变了sea基因上一个稀有密码子簇,将此段中稀有密码子全部更换成E.coli最常用密码子,得到sea^m。将sea和sea^m分别克隆于7ZTS表达载体上,并转化JM109（DE3）菌株。结果表明,sea基因的表达十分微弱,而sea^m基因的表达量十分高,约占菌体总蛋白的15 ％。表达产物在体内具有一定的抗肿瘤活性。     

D-氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较

D-氨基酸氧化酶（DAAO）在转化头孢菌素C生产7-ACA和转化DL-氨基酸制备α-酮酸和L-氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC35K上,再将表达质粒pPIC35KDAAO分别整合P. pastoris的宿主细胞KM71和GS115,经筛选获得阳性重组菌PDK13（Mut^S）和PD27（Mut⁺）。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示：PDK13（Mut^S）株比PD27（Mut⁺）株消耗甲醇慢、诱导时间长,但对通气量要求低、表达水平高,摇瓶活力分别达到2700和2500 IU/L,14L发酵罐内活力分别达到10140和8463 IU/L。初步探索了DAAO对DL-苯丙氨酸的拆分,结果显示基因工程菌表达的DAAO具有良好的转化DL-苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L-苯丙氨酸的能力。     

汉森酵母表达载体的构建和人血管生成抑制素基因的表达

汉森酵母(H.polymorpha)是一类能以甲醇为唯一碳源和能源的甲基营养酵母,具有高表达外源基因、易于高密度发酵和产业化的特点。应用PCR技术扩增汉森酵母甲醇氧化酶(Methanol oxidase MOX)基因启动子和转录终止序列,并与汉森酵母Leu基因(Hpleu2)和人血管生成抑制素基因一起重组进大肠杆菌质粒pSP72,构建了整合型表达载体pSMA17,采用LiAc法将pSMA17转入汉森酵母A16(leu),筛选出阳性转化子H.polymorpha A16(pSMA17)。转化子在YPGE培养基中培养至对数生长后期,用甲醇进行诱导表达。ELISA和SDSPAGE分析结果证明人血管生成抑制素已获表达,表达产物分泌至培养基中。Western blot结果显示重组的人血管生成抑制素能与抗人纤溶酶原抗血清特异结合,具有免疫原性。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因appA,按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA-m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southern blotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中,并确定了整合基因的拷贝数。Northern blotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到7.5×10⁶IU/mL发酵液以上, 大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究

将猪瘟病毒的E2基因克隆入酵母分泌型表达载体pPIC9K中,酶切线性化后电穿孔导入Pichia pastoris进行整合,经G418筛选得到高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDSPAGE和Western blot结果证实了酵母培养上清液中含有E2蛋白。免疫活性研究证明P. pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生抗猪瘟病毒的抗体。     

中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂在毕赤酵母中的表达和活性分析

为研究鱼类半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Cystatin）的功能并探索其在水产加工和病害防治中的应用潜力,将PCR改造后的编码成熟肽中华鲟（Acipenser sinensis）cystatin 基因亚克隆到毕赤酵母整合型表达载体pPICZαA,氯化锂法转化毕赤酵母菌株GS115,构建表达cystatin的酵母基因工程菌。经甲醇诱导、SDSPAGE检测培养基上清液,表明中华鲟cystatin在毕赤酵母中实现了高效表达,重组cystatin表达量约为215mg·L^-1。纯化后重组蛋白纯度达94.2%。生物活性检测结果表明,1μg重组中华鲟cystatin约能抑制15μg木瓜蛋白酶的水解活性。     

嗜热细菌木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中的高效表达

采用PCR技术克隆得到嗜热细菌Clostridium thermohydrosulfuricum木糖异构酶(xylose isomerase XI)基因xylA,将该基因连接于酵母表达载体pMA91的磷酸甘油激酶(PGK)启动子下,得到重组质粒pBX1。通过LiAc完整细胞转化法将重组质粒转移至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)H158受体菌中,得到重组酵母转化子H612,酶活测定结果表明,成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达。SDSPAGE电泳结果显示出明显的特异性表达产物带,单体分子量为43kD。由酿酒酵母重组子H612产生的木糖异构酶最高酶活条件与其在自然状态下的一致,均为85℃,pH70,在这一条件下酶的比活力为10U/mg蛋白,而在接近酵母最适生长温度的30℃和40℃时,其相对酶活分别下降37%和11%。研究结果显示在酿酒酵母中得到木糖异构酶的活性表达,为进一步在酿酒酵母菌中建立新的木糖代谢途径打下了基础。     

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1-木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1中克隆出木聚糖酶基因xynA,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET22b(+)上的pellB信号肽编码序列之后,得到2种构建的重组载体,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,在摇床培养水平上的表达量达到200mg/L,且表达产物具有生物学活性。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。