椭圆叶花锚简化基因组的SSR信息分析及SSR引物开发

基于RAD-seq简化基因组测序技术获得椭圆叶花锚（Halenia ellipitica D.Don）简化基因组水平上的序列信息并开发SSR分子标记。利用SR search软件检测而得到双端各有至少100 bp的五种类型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位点共6 201个,并成功设计其中3 865个SSR引物。在能成功设计引物的SSR位点中,三核苷酸SSR位点最多;重复序列长度包括17种（12~36 bp）;重复序列的基序共达316种,其中五核苷酸基序种类最多（91种）。从中挑选65对可对应五种SSR类型的引物,经梯度PCR检验后,利用椭圆叶花锚的4个居群32个个对可扩增的引物进行PCR和聚丙烯酰氨凝胶电泳检测,其中14对引物能在绝大多数个体中扩增,且13对具多态性。13个多态性位点的等位基因数量均值为5.462,多态性较高且不连锁（P<0.05）;其中10个位点在多数居群中偏离哈迪温伯格平衡（P<0.01）且存在较高的纯合子数量（观测杂合度H_o均值0.226）;近交系数在-0.443~1,均值为0.656;基因流N_m为0.474。     

思茅松转录组SSR分析及标记开发

基于思茅松转录组测序数据进行其SSR标记开发,为丰富思茅松SSR数据库提供参考。采用MISA软件对思茅松59 636条Unigene进行SSR搜索,共获得3 745个SSR位点,分布频率为6.28%,平均11.36 kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以三核苷酸基序为主,其次是二核苷酸基序,所占比例分别为49%和24%,其主要重复单元分别为AGC/CTG和AT/TA。随机挑选224个位点进行引物设计及合成,琼脂糖凝胶检测发现其中29个位点具有多态性且效果良好,但仅12个位点符合SSR重复类型的倍数大小且扩增效率高于85%。利用这12对荧光标记引物,对2个居群42份样本进行遗传多样性分析,共检测到35个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.093 2-0.480 9,平均为0.306 9。4个位点为低度多态位点(0PIC0.25),8个位点为中度多态位点(0.25PIC0.5)。这12个标记可用于思茅松遗传多样性分析、遗传图谱构建、基因定位及克隆等研究,旨为思茅松分子标记辅助育种及变异水平等研究提供技术支持。     

甘薯与牵牛EST资源的SSR信息分析

为挖掘番薯（Ipomoea）属EST-SSR资源,从NCBI数据库下载23406条甘薯（Ipomoea batatas (L.) Lam.）EST和62282条牵牛（Ipomoea nil (L.) Roth）EST,利用生物信息学软件预处理、去冗余、拼接处理后得到12812条无冗余的甘薯EST（6.70 Mb）和28422条牵牛唯一序列（17.19 Mb）。对这些序列进行SSR搜索,在甘薯上获得328个SSR位点,发生频率为2.56%;牵牛上筛选到962个SSR位点,出现频率为3.38%。甘薯和牵牛EST-SSR具有多个共同特征：在SSR位点中,主要是二核苷酸重复类型,其次是三核苷酸重复;在二核苷酸重复中,出现最多的重复基序为AG/CT,其次是AT/AT;在三核苷酸重复中,主要基序是AAG/CCT;SSR位点的长度主要集中在20~22 bp。结果表明,这些搜索出的EST-SSR重复基序类型丰富、多态性潜能高,具有较高的开发和利用价值。     

龙眼顶芽转录组简单重复序列(SSR)标记信息分析及分子标记开发

随着新一代测序技术的发展,大量的转录组数据和表达序列标签(EST)成为开发简单重复序列(SSR)标记的可利用资源。本研究利用MISA软件筛选龙眼(Dimocarpus longan)顶芽转录组数据库序列,从114 445条龙眼转录组unigene序列中发现11 546个SSR位点,SSR出现频率为10.09%。其中1 975条unigene含有两个或两个以上EST-SSR位点,占所有SSR位点的比例为17.10%,SSR出现的平均距离为7.52 kb。从龙眼转录组SSR核苷酸基序类型来看,二核苷酸(52.11%)和三核苷酸(46.15%)出现频率最高,占所有核苷酸出现频率的99.26%。在龙眼转录组SSR中二核苷酸重复基元出现频率最高的是AG/CT(4 250个,占36.81%),三核苷酸重复基元出现频率最高的是AAG/CTT(1 109个,占9.61%)。对含SSR位点的9 571条unigene序列进行引物设计,共设计出了8 347对SSR位点特异引物。随机挑选合成50对EST-SSR引物,以‘石硖’、‘储良’、‘古山2号’、‘立冬本’等四份龙眼材料的基因组DNA为模板对这批引物进行PCR扩增、筛选,结果表明,其中21对引物能产生理想的PCR产物,有效扩增率为42%;16对引物扩增条带具有多态性,占有效引物的76.2%;16对多态性引物共扩增获得50个条带,其中多态性片段21个,每对引物平均产生1.31个多态性片段。     

马铃薯甲虫基因组SSR位点分析及引物效率的验证

SSR作为一种微卫星分子标记方法,被广泛用于遗传多样性相关的研究,而SSR引物是否高效是影响整个实验结果的重要因素。本研究利用生物信息学手段,对马铃薯甲虫基因组数据进行分析,搜索基因组SSR位点,并设计引物和验证SSR引物的效率。最终在马铃薯甲虫基因组中共检测出SSR位点81 937个,且这些位点中以单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重复为主;从SSR位点的平均分布距离来看,单、三、四核苷酸重复在马铃薯甲虫基因组中平均分布距离较小,分别为2.21 kb、8.39 kb、36.21 kb。马铃薯甲虫基因组SSR位点中,优势基序总数为68 388个,比例高达83.46%,其中,单核苷酸以A/T重复基序占绝对优势,二核苷酸重复的SSR位点中,以AG/CT重复基序为主,三核苷酸重复的位点中,以AAT/ATT重复基序为主;在ClassⅠ长度的SSR位点中,以二核苷酸、三核苷酸重复的数量最多,比例高达82.32%;最后设计19对SSR引物测试效率,其中14对成功扩增条带,11对为多态性引物,其平均多态性条带6.27条。多态性引物的PIC值在0.375-0.794,平均值为0.600,大于平均值的引物为6对,占有效扩增引物的54.5%。研究表明,利用生物信息发掘SSR位点的方法简便高效,这为后续进一步利用SSR引物研究马铃薯甲虫的遗传多样性,及在其它昆虫中开发SSR引物开发奠定研究基础。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

基于转录组数据的密花香薷SSR位点特征分析

利用MISA软件对密花香薷转录组42 362条Unigene进行SSR位点搜索,并对其SSR序列结构及分布特征进行了分析。结果表明:(1)密花香薷转录组Unigene序列中共检测到17 564个SSR重复序列,分布于11 903条Unigene上,出现频率为28.10%,平均每3 200 bp出现一个SSR位点。(2)单、二、三核苷酸重复类型为密花香薷转录组SSR位点的主导基序类型,占总SSR位点的97.27%,3种主导基序类型中,单核苷酸所形成基元类型数量最多,共检测到169个基元类型(51.22%),单核苷酸(A/T)n基元类型占明显优势,二核苷酸重复类型(AG/CT)n基元类型占优,分别占总SSR位点的50.60%和12.17%。(3)单核苷酸SSR位点所包含重复次数最多(49),重复次数介于10～66,同一基序类型不同重复次数所形成的SSR位点数量差异较大,随重复次数的增加,SSR位点数呈下降趋势。(4)密花香薷转录组二至六核苷酸基序SSR序列长度集中在12～30 bp区间,共包含有8 190个SSR位点,占所统计SSR位点的95.60%,1 589 (≥20 bp)个SSR序列具有极高的多态性,占所统计SSR位点的18.54%。综合出现频率、分布密度、基元重复次数和长度变异等多个研究结果发现,密花香薷转录组检索到的SSR序列表现出较高的多态性潜能,具有较大的开发价值。该研究为后续密花香薷SSR分子标记引物开发奠定了理论基础。     

濒危植物羊踯躅全基因组SSR标记开发与鉴定研究

该研究利用基于全基因组限制性酶切位点简化基因组测序技术（RAD seq技术）,开发濒危植物羊踯躅（Rhododendron molle G. Don）全基因组SSR标记,并对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证鉴定,为进一步研究羊踯躅的遗传多样性和群体遗传结构以及保护利用提供技术支持。结果显示：（1）羊踯躅基因组测序获得原始数据7.653G bp,过滤后为7.513G bp;经组装发现,羊踯躅171.534 M bp的基因组分布在498 252 contigs中。（2）通过SSR检测,在11 961 SSR位点中获得了11 687对SSR分子标记,并且二核苷酸为基序的重复类型最丰富,达51.76%。（3）随机选取128对SSR标记在6个羊踯躅株系中进行PCR扩增,获得20对高多态性的SSR标记。（4）用所选的20对多态性SSR标记对3个群体共63份羊踯躅材料进行验证分析发现,这些多态性SSR标记位点的等位基因数为4~16个,期望杂合度（H_e）为0.489~0.908。 研究表明,羊踯躅的SSR丰度适中,且二核苷酸为羊踯躅中最丰富的重复序列,该实验进一步证明RAD seq技术是一种经济有效的基因测序方法,实验中开发的SSR引物将有助于进一步研究羊踯躅和其他近缘种的群体结构和多样性。     

基于转录组序列的长柄双花木SSR标记开发

双花木属(Disanthus Maxim.)是金缕梅科(Hamamelidaceae)最原始的单种属,为东亚地区特有属。长柄双花木(D.cercidifolius var.longipes H.T.Chang)是日本特有植物双花木(D.cercidifolius Maxim.)的变种,仅分布于我国南方地区,为国家Ⅱ级保护植物,被列入我国濒危植物种名录,在研究金缕梅科系统发育和东亚植物区系地理演化等方面具有重要的科学价值。由于可利用的SSR标记引物数量不足,阻碍了长柄双花木遗传学研究。本研究对长柄双花木转录组序列进行高通量测序,采用de novo组装方法,共获得32325条unigene。利用MISA软件,搜索到13779个SSR位点,SSR位点发生频率为42.63%,位点分布频率为1/2.95 kb。不同重复基序类型中,二核苷酸重复基序数量最多,占总数44.10%;单核苷酸重复基序次之,占总数37.90%;三核苷酸重复基序,占总数16.71%。二核苷酸重复基序中,AG/CT重复基序数量最多;三核苷酸重复基序中,AAG/CTT重复基序数目最多,其次是ATC/ATG、ACC/GGT和AGC/CTG。从不同种群中任取1株构成8株无亲缘关系的随机样本,对随机合成的60对SSR引物的有效性进行琼脂糖电泳检测的结果表明,46对引物扩增出目的条带,扩增率达76.67%。进一步利用TP-M13-SSR技术基因分型结果显示,30对引物扩增产物显示出多态性,多态位点百分比为65.22%。这表明,基于转录组序列开发的长柄双花木SSR位点多态性较高。本研究结果有助于后续的长柄双花木种群遗传学及系统进化等方面研究。     

基于磁珠富集法开发并筛选西川红景天的微卫星标记

利用FIASCO磁珠富集法,开发和筛选青藏高原特有珍贵植物西川红景天(Rhodiola alsia)多态性微卫星标记。结果表明:用(AG)15和(AC)15两种微卫星标记探针构建富集文库,共获得阳性克隆约2500个;从中随机挑取1200检测,发现具有多态性的阳性克隆达400个;随机挑取200多态性的阳性克隆进行测序,从中获得105个SSR位点,用在线软件primer3-2.3.4成功设计得SSR引物105对;其中45对可以成功扩增,而13对所扩增的片段在相距较远的4个自然居群的24个个体中显示较高的遗传多态性。用4个居群的80个个体检测这13对引物发现,平均等位基因数(A)约为9.192,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)均值分别约为0.712和0.734,如此高的多态性已经满足后期研究的需要;数个位点在某些居群中显著偏离哈迪温伯格平衡(P0.01),这可能是实际研究的居群并不能达到哈迪—温伯格定律所假设的无限大等理想状态所致。结合此前基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)序列开发的SSR多态性位点,该研究结果为今后利用SSR位点开展西川红景天的居群遗传结构分析和其他研究提供了一组有效工具。     

基于转录组测序的枫香EST-SSR引物开发及有效性评价

枫香是广西重要的乡土树种之一，具有较高的用材、观赏及药用价值。为验证枫香SSR引物的实际应用效果，该研究基于转录组测序技术，检测枫香SSR位点并设计引物，通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出具有较高多态性的枫香EST-SSR引物，并对1个枫香天然群体进行遗传多样性分析。结果表明：(1)共发掘到23 777个SSR位点，单核苷酸重复类型SSR位点占总位点比例最高(46.54%),在重复次数上5～12次之间的SSR位点占比最高(72.36%)。(2)共开发出262对SSR引物，有效扩增率为53.1%,最终筛选出扩增稳定、条带清晰的引物18对。(3)多态性检测结果显示所有位点均具有多态性，天然群体遗传多样性结果显示该天然群体中等位基因数量(Na)、有效等位基因数量(Ne)、Shannon多样性指数(I)、观测杂合度(Ho)变化范围分别为2～4、1.112 8～2.609 6、0.208 9～1.112 7和0.275 9～1.000 0,平均值分别为2.333 3、1.957 4、0.708 5和0.722 6。综上认为，枫香中占优势的SSR位点重复类型和重复基序与其他物种基本相同，所开...     

Genomic organization of molecular differentiation in Norway spruce (Picea abies)

Diversity and differentiation among three populations representing the geographical domains commonly recognized within the natural distribution area of Picea abies were analysed by using a set of 292 AFLP (amplified fragment length polymorphism), SSR (single sequence repeat) and ESTP (expressed sequence tags polymorphism) markers. As usually observed in forest trees, results showed high within-population diversity (H(S) reaching 0.79) and low among-population differentiation (G(ST) approximately 2%). The genomic organization of differentiation was then investigated on the basis of a subsample of 150 AFLP, SSR and ESTP mapped markers. The number of the loci differentiating the Baltico-Nordic from the central European populations (25 loci) and, within the central European populations, the Alpine from the Hercyno-Carpathian populations (12 loci), were different. These 37 differentiated loci, with individual G(ST) values ranging from 0.008 to 0.20, were evenly distributed on all linkage groups and mostly followed the neutral expectations, suggesting genome-wide effects on differentiation. Nine of them however behave as 'outlier' loci indicating possible locus-specific selective effects. Contribution of ongoing evolutionary forces and historical effects to the geographical differentiation of the species are discussed.     

Development and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers and their use in determining relationships among Lycopersicon esculentum cultivars

The simple sequence repeat (SSR) or microsatellite marker is currently the preferred molecular marker due to its highly desirable properties. The aim of this study was to develop and characterize more SSR markers because the number of SSR markers currently available in tomato is very limited. Five hundred DNA sequences of tomato were searched for SSRs and analyzed for the design of PCR primers. Of the 158 pairs of SSR primers screened against a set of 19 diverse tomato cultivars, 129 pairs produced the expected DNA fragments in their PCR products, and 65 of them were polymorphic with the polymorphism information content (PIC) ranging from 0.09 to 0.67. Among the polymorphic loci, 2-6 SSR alleles were detected for each locus with an average of 2.7 alleles per locus; 49.2% of these loci had two alleles and 33.8% had three alleles. The vast majority (93.8%) of the microsatellite loci contained di- or tri-nucleotide repeats and only 6.2% had tetra- and penta-nucleotide repeats. It was also found that TA/AT was the most frequent type of repeat, and the polymorphism information content (PIC) was positively correlated with the number of repeats. The set of 19 tomato cultivars were clustered based on the banding patterns generated by the 65 polymorphic SSR loci. Since the markers developed in this study are primarily from expressed sequences, they can be used not only for molecular mapping, cultivar identification and marker-assisted selection, but for identifying gene-trait relations in tomato.     

杂交兰转录组SSR信息分析及EST-SSR标记开发应用

该研究主要开发筛选适用于杂交兰的EST-SSR引物,为杂交兰种质资源评价和遗传变异研究等提供可靠的分子标记。该研究对杂交兰进行转录组高通量测序,挖掘SSR位点和开发EST-SSR标记,并对不同种质的遗传多样性进行分析。结果表明,从31724条杂交兰Unigene中检测出18603个SSR位点,SSR出现频率为58.64%;SSR位点中的主导类型是单核苷酸重复,占总SSR的65.10%,其次是二核苷酸(23.56%)和三核苷酸(10.76%)重复;优势重复基元为A/T、AG/CT、AT/AT和AAG/CTT,分别占总位点的64.72%、13.74%、8.19%和2.51%。利用Primer Premier 5.0共设计了565对SSR引物,从筛选出的64对有效扩增引物中随机选择28对引物,对40份杂交兰种质进行多态性验证与遗传关系分析,其中16对(占57.14%)引物表现出可重复的高多态性,平均多态信息量(PIC)达0.789。基于扩增的多态性SSR信息,40份种质资源可聚为4类,聚类结果与其遗传背景基本一致。该研究印证了转录组测序获得的Unigene是SSR标记开发的有效来源,开发的EST-SSR引物可为杂交兰及近缘种的良种鉴别、遗传图谱构建、分子标记辅助育种及功能基因挖掘等提供有价值的候选标记。     

芜菁SSR引物的开发及多态性分析

目的:用于芜菁的简单序列重复(SSR)标记数量有限,初步探索多态性较好SSR的结构特性,开发更多的SSR引物,有助于芜菁的研究。方法:开发680对新的SSR引物,以2个芜菁品种为模板进行多态性扩增,筛选出多态性较好的引物。结果:565(83.1%)对引物在2种芜菁之间能够有效扩增,有多态性的引物有141对(20.7%);SSR的长度与其多态性水平之间没有直接的线性关系,但SSR基序碱基数与重复次数和多态性水平之间存在一定的联系,即3碱基为基序、7次重复的SSR多态性较好。结论:SSR的类型与引物的多态性之间有一定的联系。     

竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用

为探讨观赏竹叶片异质性的机理,根据麻竹(Dendrocalamus latiflorus)和绿竹(Bambusa oldhamii)叶绿体基因组序列开发SSR分子标记。结果表明,在麻竹和绿竹叶绿体基因组中分别存在87和86个SSR位点,其中三核苷酸重复类型最多,其次为单核苷酸重复类型。根据SSR位点设计21对引物,其中11对引物对6竹种能够扩增出稳定、清晰的条带,且具有多态性,引物有效率达到52.4%。聚类分析表明,6竹种可分为两大类群,与形态学分类结果基本一致。有4对引物在菲白竹(Pleioblastus fortunei)和白纹椎谷笹(Sasaella glabra f.albo-striata)的花叶中具有多态性,可作为区分观赏竹叶片异质性的分子标记。     

基于转录组数据的齿缘刺猎蝽微卫星分子标记开发

【目的】齿缘刺猎蝽Sclomina erinacea是我国猎蝽科天敌昆虫常见种类,其不同地理种群存在明显形态差异。本研究旨在利用已经获得的齿缘刺猎蝽转录组数据筛选微卫星位点,为齿缘刺猎蝽种群遗传多样性和遗传分化研究开发可靠的微卫星分子标记。【方法】基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq^TM 2000获得齿缘刺猎蝽转录组数据(42 215条unigenes),利用MISA软件进行搜索发掘SSR标记;利用Primer Premier 3软件设计SSR引物,从中随机选取54对SSR引物,利用PCR技术在中国齿缘刺猎蝽9个地理种群上进行验证。【结果】利用MISA软件搜索到微卫星位点2 395个,它们分布在2 107条unigenes上,其主要重复类型是三核苷酸重复(占总SSR的44.43%),其次是二核苷酸重复(占总SSR的40.08%),再次是四核苷酸重复(占总SSR的12.94%)。利用Primer Premier 3 软件成功设计出2 000余对SSR引物。随机选取的54对引物对9个齿缘刺猎蝽不同地理种群进行的SSR位点PCR扩增结果表明,共有16对引物较好地扩增出目的片段。【结论】研究表明利用齿缘刺猎蝽转录组数据可以大量发掘微卫星分子标记。本研究为进一步开展齿缘刺猎蝽的种群遗传学研究奠定了基础。     

Development and transferability of apricot and grape EST microsatellite markers across taxa

EST microsatellite markers were developed in apricot (Prunus armeniaca L.) and grape (Vitis vinifera L.). cDNA libraries from either apricot leaves or grape roots were used in an enrichment procedure for GA and CA repeats. The transferability of EST simple sequence repeat (SSR) markers from apricot and grapevine to other related and unrelated species was examined. Overall, grape primers amplified products in most of the Vitaceae accessions while the apricot primers amplified polymorphic alleles only in closely related species of the Rosaceae. In this taxonomic family, ten EST SSR loci were tested, and one single primer pair, PacB22, was amplified across species and sections in the Prunoideae and Maloideae. Sequencing of EST SSR loci in other species and genera confirmed a higher level of conservation in the microsatellite motif and flanking regions in the Vitaceae compared to the Rosaceae. Two distinct fragments of the PacB22 locus amplified across the Malus and Pyrus genera; however, while the coding region was highly conserved, the microsatellite repeat motif was no longer present. The banding pattern was explained by base substitution and insertion/deletion events in the intronic region of PacB22. This study includes the determination of the degree of polymorphism detected among species and genera in two unrelated taxonomic families and the evaluation of the information provided by the microsatellite repeats and the flanking regions.     

基于简化基因组数据开发岭南青冈微卫星引物

微卫星标记（simple sequence repeat，SSR）在基因组中普遍存在，具有共显性、高多态性等特点，在群体空间遗传研究中应用广泛。随着测序技术的发展，SSR的开发方法也更加多样化。岭南青冈（Quercus championii Benth）是中国南方常绿阔叶林的珍贵材用树种，对其分子标记的开发可促进岭南青冈的育种和种质保护。本研究基于4个岭南青冈个体的简化基因组序列进行SSR引物的开发。使用pyRAD软件分析显示：①每个个体中包含微卫星重复片段的序列在46 000~84 000条；②个体内聚类后得到的位点数在5 500~24 000；③个体间聚类后获得1 158个一致性位点。在1 158个位点中获得186个侧翼序列没有变异且重复碱基位于序列中间位置的位点。使用Primer Premier 5.0设计了25对引物，在来自3个群体的36个岭南青冈个体中进行验证，结果表明17对引物能成功扩增，共获得106个等位位点，每个引物的等位基因数在2~12，平均为6.2。引物的期望杂合度和观测杂合度分别为0.19~0.88和0.11~0.76。本研究的引物开发方法具有速度快、效率高、成本低的特点，可应用于群体遗传学分子标记的开发。