髓样分化蛋白2基因沉默对高糖诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、凋亡及炎症反应的影响*

目的:研究髓样分化蛋白2(MD2)基因沉默对高糖(HG)诱导的大鼠心肌细胞增殖抑制、凋亡及炎症反应的影响及其机制。方法:体外大鼠心肌细胞系H9C2细胞随机分为4组(n=3):LG组、HG组、HG + NC组、HG + si-MD2组,分别转染MD2基因小干扰RNA(si-MD2)或阴性对照24 h后进行低糖或高糖处理48 h。RT-qPCR检测MD2及细胞内炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平,MTS法、流式细胞术检测细胞增殖能力、细胞周期和细胞凋亡率,Western blot法检测细胞内相关蛋白的表达水平及磷酸化水平。结果:转染si-MD2后,H9C2细胞中MD2的表达水平明显下降(P＜0.01)。与低糖(LG)组比较,高糖处理后的H9C2细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平显著升高,细胞增殖能力下降并发生G1期阻滞,细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白水平升高(P＜ 0.01)。而MD2基因沉默可拮抗高糖对H9C2细胞增殖、细胞周期、凋亡及细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平的影响(P＜0.05)。Western blot测定结果表明高糖处理后的H9C2细胞中细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和C-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的磷酸化水平明显升高,而MD2基因沉默可抑制高糖诱导下的ERK1/2、P38 MAPK和JNK蛋白激活(P＜0.01)。结论:MD2基因沉默可能通过抑制ERK、P38 MAPK和JNK信号通路的激活来减少高糖诱导的大鼠心肌细胞炎症细胞因子表达,减少心肌细胞凋亡,促进细胞增殖。     

RPA1低表达对辐射抵抗人鼻咽癌CNE-2R细胞侵袭迁移及细胞周期的影响*

目的: 探讨复制蛋白A1(RPA1)沉默对人鼻咽癌CNE-2R细胞侵袭、迁移及细胞周期的影响。方法: 采用shRNA技术构建RPA1低表达的CNE-2R细胞模型并通过RT-PCR和Western blot实验验证。选用空白对照组(CNE-2R)、阴性对照组(NC-shRNA)、RPA1低表达组(RPA1-shRNA)3组细胞完成后续实验,通过CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力、Transwell实验检测侵袭能力、划痕实验检测迁移能力,流式细胞术检测细胞周期;Western blot实验检测Chk2、p-Chk2、Cdc25c和p-cdc25c蛋白的表达。结果: 与CNE-2R和NC-shRNA组比较,RPA1-shRNA组细胞的RPA1mRNA和蛋白质均显著降低(P＜0.01和＜0.05);RPA1-shRNA组组细胞的增殖、侵袭、迁移能力显著下降(P均＜ 0.05),细胞周期被阻滞在G2/M期(P＜0.01);RPA1-shRNA组细胞Chk2、Cdc25c的表达低于CNE-2R和NC-shRNA组细胞(P＜0.05), 而p-Chk2、p-cdc25c的表达高于其它两组(P ＜0.05)。结论: RPA1低表达抑制辐射抵抗人鼻咽癌CNE-2R细胞的增殖、迁移以及使细胞周期阻滞于G2/M期。     

长链非编码RNA Linc00673过表达对胃癌MGC-803细胞增殖与凋亡的影响*

目的: 探讨长链非编码RNA Linc00673过表达对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法: 将重组慢病毒表达质粒pLVX-Linc00673和对照空载体质粒pLVX-NC在293T细胞中进行慢病毒包装与扩增,将重组慢病毒转染胃癌细胞MGC-803建立稳定过表达 Linc00673的细胞系,实时荧光定量PCR方法检测Linc00673基因的表达; MTT实验和克隆形成实验观察细胞的生长增殖;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;qPCR检测细胞周期相关调控基因表达;免疫印迹法检测PI3K/Akt信号通路关键分子及肿瘤增殖相关蛋白的表达。结果: Linc00673在胃癌细胞系MGC-803、BGC-823和AGS中的表达量显著高于正常胃粘膜细胞GES-1(P＜0.05)。建立了稳定过表达Linc00673的MGC-803细胞系,Linc00673的表达量比对照空载体组高200倍。Linc00673过表达促进MGC-803细胞增殖和克隆形成(P＜0.05),抑制细胞凋亡并影响细胞周期G1→S期进程(P＜0.01);Linc00673过表达可影响MGC-803细胞周期调节基因CCNG2、p19和CDK1的表达;免疫印迹结果显示,Linc00673过表达不仅促进PI3K/Akt信号通路关键分子pAKT及其下游靶点NF-κB和Bcl-2蛋白的表达,而且上调肿瘤相关因子β-catenin和EZH2蛋白的表达。结论: Linc00673过表达可能通过PI3K/Akt信号通路促进MGC-803细胞增殖、抑制凋亡。     

桦木酸对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的: 探究不同浓度桦木酸对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响。方法: 将人胃癌 MGC-803 细胞分成 4 组,每组设置 3 个复孔,对照组细胞为加入浓度为0 μg /ml的桦木酸实验组细胞分别加入终浓度为10、20、30 μg /ml 的桦木酸,各组细胞在含5%的 CO₂ 培养箱中孵育 48 h 后,使用吉姆萨染色法和台盼蓝拒染法检测桦木酸对细胞克隆形成率和生长抑制率的影响;EdU法和流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞周期变化;qRT-PCR和Western blot检测细胞周期调控因子CCNB1、CCND1的表达。结果: 与对照组相比,人胃癌MGC-803的克隆形成率显著降低(P＜0.01),生长抑制率明显升高,细胞增殖能力显著下降(P＜0.01);各实验组细胞随着桦木酸浓度的增加G1 期细胞所占比例逐渐降低, 而S 期细胞数量显著增多(P＜0.01);细胞周期调控因子CCNB1、CCND1 的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P＜0.01),30 μg /ml 的桦木酸处理组的表现最佳。结论: 在终浓度为 10～30 μg /ml 的范围内,桦木酸能够降低人胃癌MGC-803细胞增殖,抑制细胞生长,下调CCNB1和CCND1的表达将人胃癌 MGC-803细胞阻滞于G0/G1 期。     

桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响*

目的:利用不同浓度的桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞增殖的影响。方法:桦木酸设4个不同浓度(0、10、20、30 μg/ml),并采用常规化疗药物5-Fu处理作为阳性对照,以探究其对细胞增殖的影响。采用台盼蓝拒染法和吉姆萨染色法分别检测桦木酸对人胃癌SGC-7901细胞生长抑制率及克隆形成率;EdU法检测SGC-7901的细胞增殖;利用流式细胞术检测细胞周期, 应用qRT-PCR和Western blot分别检测细胞周期蛋白cyclin D1,cyclin B1的mRNA和蛋白表达水平。结果:不同浓度的桦木酸处理人胃癌SGC-7901细胞48 h后,其细胞生长抑制率显著升高(P＜0.05),克隆形成率和细胞增殖率均明显降低(P＜0.01),且呈剂量和时间依赖性;人胃癌SGC-7901细胞被阻滞在G1/G0期,细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的mRNA和蛋白表达量也随桦木酸浓度升高而显著降低(P＜0.01)。且与5-Fu对照组相比,桦木酸浓度为20 μg/ml和30 μg/ml时,细胞增殖能力明显降低,细胞周期被抑制,细胞周期蛋白表达量均明显降低(P ＜0.05)。结论:桦木酸通过下调cyclin B1和cyclin D1基因表达,将人胃癌SGC-7901细胞阻滞在G1/G0期,从而抑制细胞增殖。     

lncRNA PVT1沉默对高糖诱导的血管内皮细胞增殖、凋亡及氧化应激的影响*

目的: 探讨抑制lncRNA PVT1对高糖诱导的血管内皮细胞的增殖,凋亡和氧化应激的影响。方法: 体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为四组:对照组(5.5 mmol/L葡萄糖),高糖组(30 mmol/L葡萄糖),高糖+siNC组(30 mmol/L葡萄糖+siNC,细胞转染阴性对照组),高糖+siPVT1组(30 mmol/L葡萄糖+siPVT1,抑制lncRNA PVT1组)。采用荧光定量PCR的方法检测转染后PVT1的表达水平。MTT检测siPVT1(短片段干扰RNA PVT1)对高糖诱导的HUVECs细胞增殖能力的影响。流式细胞术检测siPVT1对高糖诱导的HUVECs细胞ROS和凋亡水平。Western blot检测HUVECs细胞中凋亡相关蛋白如Bax,Bcl-2和cleaved-caspase-3的表达水平。结果: 与对照组比较,转染siPVT1后,PVT1的表达水平显著降低(P＜0.05)。MTT结果显示,与对照组比较,培养24 h和48 h后高糖组中HUVECs细胞增殖活力均显著降低,与高糖+siNC组(阴性对照组)比较,培养24 h和48 h后,高糖+siPVT1组中的HUVECs细胞增殖活力显著增加(P＜0.05)。流式细胞术检测结果表明,与对照组比较,高糖组HUVECs细胞中ROS和凋亡率均显著增加;和高糖+siNC组比较,高糖+siPVT1组中HUVECs细胞中ROS和凋亡率均有减少(P＜0.05)。Western blot结果表明,与对照组比较,高糖组中cleaved-caspase-3和Bax表达水平均显著上调,Bcl-2的表达水平显著下调(P＜0.05,P＜0.01)。与高糖+siNC组比较,高糖+siPVT1组cleaved-caspase-3和Bax表达水平显著下调,Bcl-2的表达显著上调(P＜0.05,P＜0.01)。结论: 抑制lncRNA PVT1可以显著增加高糖诱导的HUVECs细胞增殖活力,减轻氧化应激,抑制细胞凋亡。     

Mir-335-5p靶向G6PD对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨Mir-335-5p通过靶向G6PD对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。方法: 设置正常结肠细胞组、空白对照组、NC组、miRNA-335-5p mimic组;体外培养结肠上皮细胞(IEC)和人源性结肠癌细胞SW480,并对NC组、miRNA-335-5p mimic组细胞进行转染;采用RT-qPCR检测各组细胞中miR-335-5p及G6PD mRNA表达水平;双荧光素酶报告实验验证Mir-335-5p对G6PD靶向作用;MTT实验检测各组细胞的增殖;流式细胞术检测转染后各组细胞凋亡率;Western blot检测G6PD及凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase3相对表达水平。结果: 与正常结肠细胞相比,空白对照组、NC组结肠癌细胞SW480细胞中miR-335-5p相对表达水平降低,G6PD mRNA相对表达水平升高(P＜0.05);与空白对照组、NC组相比,miR-335-5p mimic组细胞miR-335-5p表达水平明显升高,G6PD mRNA表达水平显著降低(P＜0.05)。与空白对照、NC组相比,miR-335-5p mimic组结肠癌SW480细胞生长活性显著降低,凋亡率显著升高(P＜0.05)。miR-335-5p mimic+WT-G6PD 3′-UTR组的荧光素酶相对活性低于miR-335-5p NC+WT-G6PD 3′-UTR组(P＜0.05)。与空白对照组相比,miR-335-5p mimic组细胞中G6PD、Bcl-2蛋白相对表达水平显著降低,Bax、caspase3蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)。结论: Mir-335-5p可能通过靶向G6PD抑制结肠癌细胞增殖、促进凋亡。     

固脾消积饮诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制*

目的: 探讨固脾消积饮对人肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制。方法: 将HepG2细胞分为4组:对照组(Control)、空白血清组(Blank)、固脾消积饮血清组(GPXJY)和顺铂组(Positive),每组设置8个复孔。固脾消积饮含药血清和顺铂干预24 h后,检测细胞活性、活细胞数量、细胞凋亡状态、细胞周期以及线粒体膜电位状况,检测细胞的脂质过氧化(MDA)水平、糖酵解速率和凋亡Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达,检测细胞上清液三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、丙酮酸和葡萄糖的含量。结果: 与Control组比较,GPXJY组(细胞的)抑制率增加、细胞数量减少、凋亡阳性细胞数增多(P＜0.01),G1期细胞数目显著增加(P＜0.05),细胞线粒体膜电位降低(P＜0.01),糖酵解功能显著抑制,细胞中MDA水平升高,细胞Bax、Caspase-3的表达升高、Bcl-2的表达下降(P＜0.05,P＜0.01),细胞上清液中TC、TG、葡萄糖含量显著减少、丙酮酸含量显著增加(P＜0.05,P＜0.01)。结论: 固脾消积饮可诱导HepG2细胞发生凋亡,可能对能量代谢发挥作用。     

四逆散对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及其机制*

目的: 探讨含四逆散药液血清对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法: 将人肝癌HepG2细胞分为5组,每组3个复孔。实验组细胞用五氟尿嘧啶(5-FU)或不同浓度的含四逆散药液血清处理48 h后,用倒置显微镜观察含四逆散药液血清处理后人肝癌HepG2细胞形态的变化;MTT法检测含四逆散药液血清对HepG2细胞生长的抑制作用;荧光染色和流式细胞术分别分析含四逆散药液血清对HepG2细胞凋亡的影响。Rho123染色法检测线粒体膜电位变化,Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果: 与对照组比较,含四逆散药液血清处理人肝癌HepG2细胞后,细胞数量显著减少(P＜0.01),形态发生改变,呈现典型的凋亡细胞形态;G1期细胞数明显增加,而G2 期细胞数量显著减少(P＜0.05);Bax、Caspase-3、-9和Cyt-c的表达显著升高,而Bcl-2的表达显著降低(P＜0.05);随着含四逆散药液血清浓度增大,HepG2细胞线粒体膜电位显著下降(P＜0.05)。结论: 四逆散可以抑制HepG2细胞增殖,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡。     

Sox11基因对发育期小鼠大脑皮层神经元迁移的影响

目的: 以小鼠为实验动物研究精神分裂症易感基因Sox11对皮层神经元迁移的影响。方法: 应用实时荧光定量PCR、原位杂交等技术明确发育期 (E14.5, P0, P7, P14) Sox11于大脑皮层的表达模式;应用质粒构建、转染、胚胎电转、免疫荧光染色等技术,对不同时期 (E17.5, P0, P4, P7) 的小鼠分别转染对照shRNA质粒、mSox11 shRNA质粒和mSox11 shRNA干扰恢复后质粒,研究Sox11在神经元放射性迁移中的作用。结果: 与对照组神经元相比,转染mSox11 shRNA的神经元迁移明显延迟。当对照组神经元有一部分已经到达新皮层的表层时,大部分转染mSox11 shRNA的神经元仍停留在新皮层中间区;使用大鼠Sox11基因 (rSox11) 过表达载体对小鼠Sox11基因的干扰进行恢复后,神经元迁移完成后的分布情况与对照基本一致。小鼠Sox11干扰后和干扰恢复后,室管膜下区 (SVZ)、中间区 (IZ) 和皮层板 (CP) 内迁移神经元分布具有显著性差异 (P＜0.01)。结论: Sox11可以促进皮层神经元的迁移,提示Sox11在小鼠皮层神经元迁移过程中发挥重要功能。     

沉默Smad4基因表达抑制猪卵巢颗粒细胞增殖并使细胞G_1期阻滞

Smad4是TGF-β/Smad信号通路的核心下游信号分子.为探明Smad4基因对猪卵巢颗粒细胞增殖及细胞周期的影响,采用RNA干扰技术,设计并合成猪Smad4基因的靶向小分子干扰RNA,由LipofectamineTMRNAiMix介导转染体外培养的猪卵巢颗粒细胞.应用实时荧光定量PCR检测Smad4mRNA的干扰效果,应用MTT法、流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期的变化,同时应用荧光定量PCR检测转染前后CyclinD1、CyclinB、CyclinA2、CDK1、CDK2、CDK4等周期相关基因的mRNA表达量的变化.实验结果显示,靶向猪Smad4的特异性siRNA序列对Smad4mRNA表达的抑制率为79.85%(P0.01);沉默Smad4可以显著抑制猪卵巢颗粒细胞增殖,并且改变细胞周期分布,G0/G1期细胞比例显著高于各对照组(P0.05),S期细胞比例显著低于各对照组(P0.05),细胞分裂被阻滞;转染36h后CyclinD1、CDK1的mRNA表达量显著低于对照组,CyclinA2、CDK2、CDK4极显著低于对照组,CyclinB差异不显著.综上所述,Smad4是影响猪卵巢颗粒细胞增殖及细胞周期进程的重要基因之一.     

调节TGF-β1/Smad信号通路对内质网应激状态下肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的: 探讨TGF-β1/Smad信号通路对内质网应激(ERS)状态下肝癌HepG2细胞凋亡的影响机制。方法: 首先建立内质网应激模型:以3 μmol/L的衣霉素(TM)处理人肝癌HepG2细胞株24 h,诱导细胞发生ERS。实验分为6组,每组3个复孔,实验重复3次,6组分别为:Untreated组(未处理组)、TM组(3 μmol/L TM处理组)、TM+NC组(3 μmol/L TM+si-TGF-β1阴性对照组)、TM+si-TGF-β1组(3 μmol/L TM+si-TGF-β1组)、TM+pEX-3组(3 μmol/L TM+质粒对照组)及TM+TGF-β1 pEX-3组(3 μmol/L TM+TGF-β1过表达质粒组),利用脂质体的方法将TGF-β1小干扰RNA(si-TGF-β1)及TGF-β1过表达质粒(TGF-β1 pEX-3)转染入HepG2细胞,转染24 h后,利用RT-qPCR和Western blot检测各组HepG2细胞TGF-β1/Smad信号通路相关因子TGF-β1、p-Smad2表达的情况;CCK-8和流式细胞术分别检测各组HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率变化情况。结果: 与Untreated组相比,TM组细胞的TGF-β1及p-Smad2的表达明显降低(P＜0.05);与TM组相比,TM+si-TGF-β1组细胞的TGF-β1及p-Smad2的表达和细胞的增殖抑制率、凋亡率显著降低(P＜0.01),而TM+TGF-β1 pEX-3组细胞的TGF-β1及p-Smad2的表达和细胞增殖抑制率、凋亡率显著升高(P＜0.01)。结论: TGF-β1/Smad信号通路在肝癌HepG2细胞发生ERS后受到抑制,当该通路被激活后,ERS状态下肝癌HepG2细胞的凋亡率显著升高。     

新型多胺代谢酶抑制剂SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖的影响及其机制*

目的: 探讨本实验室新发现的新型多胺代谢酶小分子抑制剂SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖、自噬和凋亡的影响。方法: 体外培养CT-26细胞,以0 μmol·L^-1 SI-4650处理48 h细胞为正常对照组,单独2.5 mmol·L^-1 3-MA处理细胞为自噬抑制对照组,40、80 μmol·L^-1SI-4650处理48 h细胞以及3-MA联合40、80 μmol·L^-1SI-4650处理48 h细胞为4个实验组,化学发光法检测CT-26细胞中多胺代谢酶SMO和APAO酶活性的变化,HPLC法检测细胞中多胺含量的变化,CCK8法检测CT-26细胞增殖能力变化;PI单染结合流式细胞术分析细胞周期;Western blot法分析细胞自噬;PI/FITC-Annexin V双染、JC-1荧光探针和Fluo-3 AM钙离子荧光探针分别结合流式细胞术以及Western blot法分析细胞凋亡。结果: 与正常对照组比较,40、80 μmol·L^-1 SI-4650实验组细胞生长抑制率分别为36.98%、46.91%,有效抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.01);同时细胞中SMO和APAO酶活性下降(P＜ 0.01);细胞中多胺总含量减少(P＜0.01);CT-26细胞被阻滞在G0/G1期(P＜0.01);凋亡细胞数分别为7.69%和 16.87%,细胞中钙浓度增加(P＜0.01)、线粒体膜电位下降(P＜0.01),c-PARP、Bax表达增加(P＜0.01)、Bcl-2含量减少(P＜0.01);以及CT-26细胞中自噬相关蛋离子白Beclin-1、LC3-Ⅱ以及P62含量显著上升(P＜0.01)。与单独40、80 μmol·L^-1SI-4650处理组相比,2.5 mmol·L^-1 3-MA联合40、80 μmol·L^-1SI-4650实验组细胞自噬水平下降(P＜0.01),凋亡相关蛋白、线粒体膜电位和钙离子浓度变化均减弱(P＜0.01),凋亡细胞数减少(P＜0.01)。结论: SI-4650有效抑制结肠癌CT-26细胞增殖,机制可能与抑制多胺代谢酶活性,干扰多胺代谢,减少多胺总含量以及诱导细胞周期阻滞、细胞自噬和凋亡相关。     

抑制素α基因表达下调对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和增殖的影响

抑制素α基因是控制家禽排卵率的一个重要候选基因。为研究抑制素α基因对体外培养的鹅卵泡颗粒细胞增殖凋亡的遗传作用,构建psiRNA-INHα1和psiRNA-INHα2两个抑制素α基因干扰载体,以降低抑制素α基因表达。体外培养鹅F1和闭锁卵泡的颗粒细胞,经抑制素α基因干扰48h后,荧光显微镜检测转染效率,同时用流式细胞术检测抑制素α基因表达水平,以及细胞生长周期、细胞凋亡指数和增殖指数的变化,用放免法测定细胞培养上清中雌激素和孕酮水平。结果表明,抑制素α基因干扰后卵泡颗粒细胞抑制素表达水平比对照组降低30%～40%（P〈0.05）;细胞凋亡指数和增值指数显著高于对照组（P〈0.05）;细胞分泌雌激素水平显著下降（P〈0.05）。由此推断,抑制素α基因对颗粒细胞具有显著的抗凋亡效应。     

桦木酸对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响*

目的: 以人胃癌SGC-7901细胞为研究对象,探究桦木酸对其凋亡的影响。方法: 将人胃癌SGC-7901细胞分为4组,每组设置3个复孔,对照组未加入桦木酸,而三组实验组分别加入浓度为10 mg/L、20 mg/L及30 mg/L的桦木酸,将各组细胞放入5%的CO₂培养箱中培养48 h,激光共聚焦显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化;qRT-PCR和Western blot分别检测SGC-7901细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3在mRNA和蛋白水平的表达。结果: 与对照组相比,终浓度为10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L的桦木酸处理组,细胞发生皱缩、细胞核裂解并出现凋亡小体;细胞早期凋亡与晚期凋亡率显著增加(P＜0.05 or P＜0.01),线粒体膜电位明显降低(P＜0.05 or P＜0.01);细胞凋亡相关基因Bax和Caspase-3的mRNA与蛋白表达水平均显著上升(P＜0.01),而Bcl-2的mRNA与蛋白表达水平显著降低(P＜0.01)。结论: 在一定浓度范围内,桦木酸通过调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡。     

GW501516对低氧条件下肺动脉平滑肌细胞增殖的作用及其机制*

目的: 观察过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对低氧原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的影响,并探讨其可能机制,为低氧肺血管重构的防治寻找新靶点。方法: 对照组PASMCs采用21%氧气培养,低氧组采用 3％氧气诱导PASMCs增殖,通过不同浓度的GW501516(10、30、100 nmol/L)低氧条件下孵育PASMCs 12、24、48 h筛选GW501516抑制低氧PASMCs增殖的最适浓度;选择100 nmol/L GW501516和(或)蛋白激酶B(AKT)激动剂SC79在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,探讨GW501516抑制PASMCs增殖可能机制,通过CCK-8与BrdU试剂盒检测细胞增殖与DNA的合成,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR(RT-PCR)检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1,细胞周期蛋白激酶抑制蛋白p27(p27)mRNA的表达,Western blot检测PPARδ、总的和磷酸化蛋白激酶B(AKT)与糖原合酶激酶3β(GSK3β)的表达。结果: 与低氧组相比,不同浓度的GW501516(10、30、100 nmol/L)干预12、24、48 h后能够抑制低氧条件下PASMCs增殖与DNA的合成,且100 nmol/L GW501516抑制作用最强(P＜0.05或P＜0.01);与对照组相比,100 nmol/L GW501516干预PASMCs 24 h能够显著上调PPARδ的表达,而低氧可显著下调PPARδ的表达(P＜0.01);与低氧组相比,100 nmol/L GW501516干预24 h后能够显著抑制PASMCs增殖与DNA的合成(P＜0.01),增加处于G0/G1期的PASMCs比例,明显减少S期和G2/M期的PASMCs比例(P＜0.05 或P＜0.01),显著抑制Cyclin D1 mRNA的表达并促进p27 mRNA的表达(P＜ 0.01),显著抑制AKT与GSK3β磷酸化(P＜0.01),而与100 nmol/L GW501516低氧组相比,AKT激动剂SC79能够逆转100 nmol/L GW501516 上述作用(P＜0.05或P＜0.01)。结论: GW501516通过抑制AKT/GSK3β信号通路抑制低氧条件下PASMCs增殖。     

补骨脂素对TCP磨损颗粒所致大鼠成骨细胞损伤的干预作用及其机制

目的: 探讨补骨脂素(psoralen)对TCP磨损颗粒诱导成骨细胞损伤的影响及其分子机制。方法: 通过消化法从SD大鼠乳鼠颅骨中获取原代的成骨细胞,应用碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞。TCP磨损颗粒(0.1 mg/ml)与成骨细胞共孵育48 h构建成骨细胞损伤的体外实验模型,实验随机分为正常对照组(Control)、模型(TCP)组和psoralen(10^-7 mol/L、10^-6 mol/L和10^-5 mol/L)组。WST法和流式细胞术分别检测各组成骨细胞活性变化和凋亡情况;化学比色法检测成骨细胞中ALP活性;各组成骨细胞培养14 d后应用茜素红S染色观察矿化结节形成。Western blot法检测各组成骨细胞中葡萄糖调节蛋白78/94(GRP78/94)、肌醇依赖酶1α(IRE1α)、剪切型X盒结合蛋白1(XBP1s)和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)等蛋白质的表达。结果: 与Control组比较,TCP组成骨细胞活性、ALP活性和矿化结节的生成显著降低(P＜0.05),细胞凋亡率、GRP78/94、IRE1α、XBP1s和p-JNK等蛋白质表达明显增加(P＜0.05);与TCP组比较,补骨脂素各组成骨细胞损伤情况明显减轻,细胞凋亡率显著减少(P＜0.05),GRP78/94、IRE1α、XBP1s和p-JNK等蛋白质表达也明显下降(P＜0.05)。结论: 补骨脂素可抑制TCP磨损颗粒诱导的IRE1α-XBP1s-JNK信号通路的激活,阻止TCP颗粒所致的成骨细胞损伤及凋亡。     

miR-125b-5p对人血管瘤内皮细胞HemES增殖和凋亡的影响及其机制

目的: 研究miR-125b-5p 对人血管瘤内皮细胞HemECs增殖、凋亡的影响。方法: RT-qPCR检测人血管瘤内皮细胞HemECs及其旁系组织细胞中miR-125b-5p与MCL-1 mRNA的表达;选取HemECs细胞分为对照组、miR-NC组、miR-125b-5p mimic组、miR-125b-5p inhibitor组、pc-MCL-1组、miR-125b-5p+ pc-MCL-1组,每组设9复孔。将100 nmol · L^-1 的miR-NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor 、pc-MCL-1质粒分别或联合转染进入HemECs细胞。MTT法检测HemECs细胞增殖;流式细胞术检测HemECs细胞凋亡; 双荧光素酶报告检测靶向关系;蛋白印迹法检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-p70s6k/ p70s6k、p-AKT/AKT、p-mTOR/ mTOR蛋白相对表达水平。结果: 通过比较miR-125b-5p在血管瘤组织和细胞中的表达水平,选择下调效果比较明显的HemECs细胞系进行后续实验。与对照组相比,miR-125b-5p mimic组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显减少(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显升高、Bcl-2表达明显降低(P＜0.01),p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显下调(P＜0.01);miR-125b-5p inhibitor组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达升高(P＜0.05,P＜ 0.01)。miR-125b-5p靶向下调MCL-1。与miR-125b-5p mimic组相比,miR-125b-5p+ pc-MCL-1组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P＜0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达明显升高(P＜0.01), p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显上调(P＜0.01)。结论: miR-125b-5p抑制人血管瘤内皮细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与靶向下调MCL-1表达,抑制AKT / mTOR通路激活等有关。     

基于CRISPR/Cas9-SAM系统CHD5基因过表达慢病毒载体的构建及对膀胱癌T24细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响 *

目的 利用CRISPR/Cas9-SAM系统构建CHD5基因过表达慢病毒载体,并分析其对膀胱癌细胞T24增殖,迁移和侵袭能力的影响.方法: 针对CHD5基因设计3个sgRNA(sgRNA-1,sgRNA-2,sgRNA-3),将sgRNA连入LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo载体,经293T细胞包装后获得高滴度慢病毒颗粒.病毒以MOI=10感染膀胱癌细胞T24.RT-qPCR和Western blot分别检测感染病毒后T24细胞CHD5 mRNA和蛋白表达水平,CCK8实验,流式分析,划痕实验和Transwell实验检测CHD5过表达对T24细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭能力的影响.结果: 成功构建CHD5过表达慢病毒载体.慢病毒感染T24细胞后,RT-qPCR和Western blot证实,T24细胞CHD5的mRNA和蛋白表达水平显著高于空白组和阴性对照组(P<0.05),并且sgRNA-3-MS2-P65-HSF1序列的作用最为显著.CCK8及流式分析结果显示,过表达CHD5抑制T24细胞增殖,促进凋亡,与对照组相比,均有统计学意义(P<0.001).划痕和Transwell实验结果表明,过表达CHD5可抑制T24细胞迁移和侵袭能力(P<0.01).结论: 成功构建CHD5过表达慢病毒.过表达CHD5能促进膀胱癌细胞T24凋亡,抑制其增殖,迁移和侵袭能力.     

TOFA对人食管鳞癌Eca109和KYSE-450细胞生长的影响*

目的: 探讨5-十四烷氧基-2-呋喃酸(TOFA)对人食管鳞癌(ESCC)细胞Eca109和KYSE-450细胞增殖、周期和凋亡的影响。方法: 将Eca-109细胞和KYSE-450细胞分为对照组(DMSO)和实验组(TOFA),细胞(4×10³ cells/100 μl)接种于96孔板中,每个浓度设置5个复孔,培养24 h后,给予DMSO(对照)和不同浓度(1、3、5、10 μg/ml)TOFA处理,继续培养24、48和72 h;MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western blot检测p21、Cleaved caspase-3表达水平及p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1修饰水平,专用试剂盒检测细胞内游离脂肪酸。结果: 与DMSO组比较,TOFA以浓度和时间依赖性方式抑制Eca109和KYSE-450细胞增殖(P均<0.05),处理48 h的IC₅₀分别为4.65和3.93 μg / ml;实验组细胞G2 / M 期细胞百分比增加,细胞凋亡率增高,p21、Cleaved caspase-3蛋白表达水平上调(P均<0.05),p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1修饰水平下调(P均<0.05)。结论: TOFA抑制人食管鳞癌细胞增殖、阻滞细胞周期并促进细胞凋亡,其机制可能与其抑制AKT/mTOR/4EBP1信号通路有关。