酿酒酵母HAL1基因的克隆及植物表达载体的构建

HAL1基因是酵母中重要的耐盐基因。以酿酒酵母AS2.375菌株的DNA为模板,根据已发表的序列设计引物,经PCR扩增得到约900 bp的HAL1基因片段,连接到pMD18-T载体上,转化大肠杆菌JM109,筛选重组质粒进行酶切分析和序列测定,结果显示已克隆到完整的可读框,该基因的序列与已知序列同源性达99%。将HAL1基因从T-载体上切下连接到pAM194载体上构建了HAL 1基因的植物表达载体,用于烟草的转化获得了耐盐性提高的转化植株。     

根癌农杆菌介导的乙肝表面抗原基因对烟草的转化

构建了植物表达载体pBRSAg,该载体具有完整的植物表达元件,CaMV35S启动子、农杆菌T-DNA左右边界、植物报告基因gus和植物选择标记基因hpt,适用于农杆菌的转化;通过冻融法将重组质粒pBRSAg转入根癌农杆菌LBA4404中,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,经筛选培养获得烟草植株。抗性植株经GUS染色和PCR检测为阳性,初步表明乙肝表面抗原基因在烟草中得到表达。     

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i,通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测,得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株,初步证明目的基因已整合到烟草基因组中;RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性;通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较,结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高;通过纤维蛋白平板法检测其活性,共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈,说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。     

PttGA20ox1基因在转化烟草植株中的表达

构建了P ttGA 20ox 1基因的植物表达载体并在烟草植株中进行了表达.结果表明:转化烟草与对照烟草之间以及转化烟草之间的形态特征出现很大差异;所有转P ttGA 20ox 1基因烟草的顶端优势得到明显促进,其生长速度明显高于对照烟草.实验结果为今后利用P ttGA 20ox 1基因促进木本植物的顶端优势奠定了基础.     

甜瓜ACC氧化酶反义基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aACO1上切下大小约2．3kb的目的基因,将其定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因的甜瓜ACC钣化酶反义基因植物表达载体pCB-aACO1。采用直接转化法将pCB-aACO1导入根癌农杆菌菌株EHA105,并用新构建的工程菌对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中,此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。     

Cu/Zn-SOD基因植物表达载体的构建及其在烟草中的表达

为研究Cu/Zn-SOD基因在提高转基因植物抗逆性方面的作用,从一株地热芽孢杆菌(Geobacillus)中克隆得到Cu/Zn-SOD基因,以pZP211质粒为表达载体,构建了植物表达载体pZP211-Cu/ZnSOD,并通过农杆菌介导对烟草进行遗传转化.经PCR检测证明已获得转Cu/Zn-SOD基因的烟草.进而测定转基因烟草的SOD活力,结果表明Cu/Zn-SOD基因在烟草中高效表达.对转基因烟草进行耐盐性检测,证明Cu/Zn-SOD基因确实能够提高烟草对盐胁迫的耐受性.     

DHDPS突变基因作为转基因植物筛选标记的研究

从烟草（Nicotiana tabacum L.cv ）中克隆得到赖氨酸合成过程中的关键酶基因二氢吡啶二羧酸合酶（dihydrodipicolinate synthase, DHDPS）基因（dhdps）,对其进行体外分子改造,以解除末端产物对它的反馈抑制。将突变基因用做转基因植物的筛选标记转化烟草,用赖氨酸类似物（S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸,AEC）作为筛选剂,成功筛选到了PCR阳性植株。Real-time PCR结果表明,PCR阳性植株中dhdps基因的转录水平显著高于对照,但植株表型异常。     

华南象草PpCAD基因的亚细胞定位及其在转基因烟草中的异源表达

该研究根据已克隆的华南象草(Pennisetum purpureum cv.Huanan)肉桂醇脱氢酶(CAD)基因PpCAD的cDNA序列,构建亚细胞定位载体pAN580-PpCAD,用PEG介导法转化象草原生质体,以探究PpCAD蛋白在细胞内的定位;同时构建植物过表达载体pBA002-PpCAD,通过农杆菌介导法在烟草中异源表达,以研究PpCAD基因与植物木质素合成的关系。结果显示:(1)PpCAD定位在象草原生质体的细胞质内;(2)过表达载体pBA002-PpCAD转化烟草后获得27株转基因烟草,其中25株PCR鉴定为阳性;(3)半定量RT-PCR检测6株转基因烟草后发现,PpCAD基因在不同植株的表达量存在差异,通过Southern杂交检测后发现该差异与目的基因插入的拷贝数有关;(4)6株转基因烟草和野生型烟草表型上没有明显差异,除目的基因多拷贝插入的植株OEC6外,木质素含量有不同程度的提高,最高比野生型提高了56.50%。研究表明,PpCAD是一个细胞质蛋白,在烟草中过表达PpCAD能够提高植株木质素含量,表明PpCAD基因参与了植物的木质素合成,可用于象草的木质素调控研究。     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b（Human interferon α-2b,HuIFN α-2b）编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。