二氢青蒿素通过诱导铁死亡抑制肝癌细胞生长

二氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）是青蒿素的一种衍生物,在多种肿瘤中表现出明显的抗肿瘤活性,但其具体机制不详。本文探讨了DHA对肝癌细胞的毒性作用机制。利用CCK-8试剂检测DHA对肝癌细胞株活力的影响,通过荧光探针染色及流式细胞术分析细胞内ROS及脂质过氧化物水平的变化;通过谷胱甘肽测定试剂盒检测细胞内还原型谷胱甘肽含量的变化,并通过免疫印迹分析DHA作用下细胞内铁死亡通路蛋白质中GPX4的变化。结果发现,DHA能显著抑制SMMC-7721及Huh-7细胞活力,其半数抑制浓度分别为23.74 μmol/L及26.92 μmol/L。 在35 μmol/L DHA 处理下,SMMC-7721及Huh-7细胞内ROS分别升高2.6倍和2.1倍,脂质过氧化物升高2.3倍和1.7倍。DHA可诱导细胞内GSH含量下降,并能下调铁死亡相关蛋白质GPX4蛋白水平。通过利用小分子抑制剂进行功能恢复实验发现,ROS抑制剂、铁螯合剂及铁死亡抑制剂都可不同程度恢复DHA引起的细胞活力下降。进一步检测发现,铁死亡抑制剂可抑制DHA诱导的脂质过氧化,并恢复GSH含量及GPX4蛋白水平。结果表明,在肝癌细胞中,DHA可通过诱导细胞发生铁死亡抑制肝癌细胞生长。     

肿瘤细胞死亡的一种新形式——铁死亡

铁死亡是近年来发现的一种程序性细胞死亡新形式,其主要特征是在发生于线粒体内的铁依赖性脂质过氧化物损伤诱导的细胞死亡。铁死亡细胞在形态、蛋白质及基因水平的变化均不同于细胞凋亡、坏死和自噬。2012年,铁死亡概念首次被提出后,铁死亡逐渐成为科学研究的热点。Erastin以及RSL3是铁死亡的诱导剂,谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）是铁死亡的关键调节点,GPX4的表达量减少或活性降低均可诱导铁死亡的发生。胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白（system Xc^-）可将细胞内的谷氨酸排出,同时将细胞外胱氨酸转运入细胞内,促进细胞内谷胱甘肽的合成,维持GPX4酶的活性。新近的研究表明,p62-keap1-Nrf2、P53-SAT1-ALOX15是铁死亡的关键调控通路,p53、BECN1以及BAP1是铁死亡的关键调节因子。Erastin以及RSL3可以选择性杀死RAS突变的肿瘤细胞,且越来越多的研究也证明,诱导肿瘤细胞铁死亡在免疫治疗以及逆转耐药方面均有着重要作用。因此,调控肿瘤细胞铁死亡很可能成为治疗肿瘤的新手段。本文就诱导肿瘤细胞铁死亡的机制及其进展作一综述。     

肿瘤细胞死亡的一种新形式——铁死亡

铁死亡是近年来发现的一种程序性细胞死亡新形式,其主要特征是在发生于线粒体内的铁依赖性脂质过氧化物损伤诱导的细胞死亡。铁死亡细胞在形态、蛋白质及基因水平的变化均不同于细胞凋亡、坏死和自噬。2012年,铁死亡概念首次被提出后,铁死亡逐渐成为科学研究的热点。Erastin以及RSL3是铁死亡的诱导剂,谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）是铁死亡的关键调节点,GPX4的表达量减少或活性降低均可诱导铁死亡的发生。胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白（system Xc^-）可将细胞内的谷氨酸排出,同时将细胞外胱氨酸转运入细胞内,促进细胞内谷胱甘肽的合成,维持GPX4酶的活性。新近的研究表明,p62-keap1-Nrf2、P53-SAT1-ALOX15是铁死亡的关键调控通路,p53、BECN1以及BAP1是铁死亡的关键调节因子。Erastin以及RSL3可以选择性杀死RAS突变的肿瘤细胞,且越来越多的研究也证明,诱导肿瘤细胞铁死亡在免疫治疗以及逆转耐药方面均有着重要作用。因此,调控肿瘤细胞铁死亡很可能成为治疗肿瘤的新手段。本文就诱导肿瘤细胞铁死亡的机制及其进展作一综述。     

高糖通过诱导铁死亡抑制骨髓基质细胞成骨分化

该研究旨在探究高糖抑制骨髓基质细胞(bone marrow stroma cells,BMSCs)成骨分化的作用及其可能的机制。采用25.5 mmol/L的葡萄糖(HG)模拟高糖微环境,通过碱性磷酸酶(ALP)染色及生化定量检测成骨分化水平,qRT-PCR检测成骨分化相关基因mRNA表达水平,CCK-8检测细胞增殖活性,荧光探针H2DCFDA检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,脂质过氧化氢荧光探针Liperfluo检测脂质过氧化产物(lipid peroxidation products,LPO)水平,流式细胞仪定量检测平均荧光强度,Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的表达水平,透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)观察线粒体超微结构。结果显示,高糖(HG)显著抑制BMSCs成骨分化及细胞增殖活性,导致细胞内ROS及LPO水平显著升高,而铁死亡抑制剂可以恢复BMSCs成骨分化及细胞增殖活性,降低ROS及LPO水平,除此以外高糖(HG)导致BMSCs线粒体皱缩、体积变小、膜密度增高、嵴减少、细胞核形态变化不明显等铁死亡样改变。综上所述,高糖通过诱导铁死亡从而抑制BMSCs成骨分化功能。     

铁死亡的表观遗传调控机制

铁死亡是一种新型的细胞程序性死亡方式,参与多种疾病的发生发展。对铁死亡调控机制的深入研究会帮助我们从新的角度去认识疾病的发生机制和探究潜在的药物干预靶点。因此,本文对铁死亡的表观遗传调控机制的最新研究进展进行了综述。研究发现,组蛋白的修饰如组蛋白甲基化、乙酰化和单泛素化等,能够通过激活或抑制铁死亡相关的溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7 Member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)等基因的转录进而调控铁死亡的发生。此外,DNA/RNA甲基化也影响着铁死亡的发生,如GPX4上游DNA甲基化的增加会导致脂质活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累从而促进细胞发生铁死亡。本文综述了近些年参与铁死亡调控的包括小分子RNA(microRNA)、长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环状RNA(circular RNA,circRNA)在内的非编码RNA的研究,发现非编码RNA也可以通过靶向调控谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成、脂质ROS和GPX4活性等,在多种疾病尤其是肿瘤疾病的铁死亡过程中起举足轻重的作用。     

α-硫辛酸对缺氧应激肝癌细胞线粒体呼吸率和产能代谢的影响

通过实验阐明抗氧化剂α-硫辛酸（alpha-lipoic acid,α-LA）对肝癌细胞内活性氧具清除作用,并发现其对肝癌细胞和正常肝细胞增殖有不同作用影响。在缺氧条件下,研究使用抗氧化剂干预对肝癌细胞和正常肝细胞缺氧耐受性,线粒体活性和产能代谢的影响及差异。以SMMC-7721人肝癌细胞和L02正常肝细胞作为研究对象,在α-硫辛酸干预条件下检测细胞生长曲线和细胞内ROS;分别在单纯缺氧及加α-硫辛酸缺氧条件下,检测细胞存活率、细胞内ROS、细胞耗氧率、细胞生成ATP和癌基因c-myc mRNA的表达。实验结果说明：缺氧情况下,肝癌细胞通过增加糖酵解途径的产能方式诱导ATP能量代偿能力提高。使用抗氧化剂α-硫辛酸干预清除细胞内过剩ROS,能降低肝癌细胞线粒体呼吸率,并能通过下调c-myc表达抑制肝癌细胞的增殖及降低其缺氧耐受性。     

谷胱甘肽在肝脏疾病相关信号通路中的作用及研究进展

谷胱甘肽(GSH)是细胞内主要的抗氧剂和氧化还原、细胞信号调节器,它能还原过氧化氢、清除活性氧(ROS)和含氮自由基使细胞免受氧化应激损伤。不管细胞内是否存在ROS氧化细胞蛋白,谷胱甘肽均能诱导氧化还原反应发生转变,进一步使信号传导功能及转录因子分子功能发生改变。大量实验表明,ROS和GSH在多条细胞信号调节通路中发挥着重要作用。主要阐述了Fas、TNF-α和NF-κB信号通路及线粒体凋亡途径及GSH在这些通路中的作用。尤其是线粒体GSH耗竭能诱导线粒体内ROS显著增加,从而损害细胞生物能量和诱导线粒体通透性转换孔开启。根据线粒体损害程度,NF-κB信号通路可被抑制,肝细胞也可能经历不同的死亡模式(凋亡或坏死)并对刺激细胞死亡信号(如TNF-α)也更敏感。这些过程涉及许多肝脏疾病的发病机理。     

五味子多糖对SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响

[目的]研究五味子多糖(SCP)对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。[方法]不同浓度SCP作用于SMMC-7721,cck-8法检测药物对细胞增殖的影响;Tunnel检测细胞凋亡变化。[结果]SCP能够抑制肝癌细胞的增殖。荧光显微镜下可见细胞呈现典型的凋亡细胞形态。[结论]SCP能抑制肝癌细胞的增殖,诱导凋亡。但详细机制尚需进一步研究。     

EPA诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及端粒酶活性调控机制研究

目的:探究二十碳五烯酸(Eicosa Pentaenoic Acid.EPA)对SMMC-7721人肝癌细胞的凋亡、端粒逆转录酶h TERT的调控作用及端粒酶表达活性的影响。方法:体外培养SMMC-7721人肝癌细胞,用不同浓度的EPA(0μM、25μM、50μM、100μM、200μM)作用于SMMC-7721肝癌细胞(24 h、48 h、72 h)后,显微镜下观察其形态学变化;应用MTT法检测SMMC-7721肝癌细胞细胞增殖变化情况;Western-blot法检测h TERT、Bax、Bcl-2蛋白表达水平变化;Real Time-PCR检测h TERTm RNA的表达变化;ELISA法检测SMMC-7721肝癌细胞端粒酶活性的表达水平。结果:EPA可诱导肝癌细胞SMMC-7721发生细胞凋亡,具有明显的时间计量依赖关系。在此过程中Bcl-2蛋白表达的降低和Bax蛋白表达上调,同时端粒酶逆转录酶h TERT蛋白及其m RNA的表达水平和端粒酶活性均明显降低。结论:抑制端粒酶逆转录酶基因(h TERTm RNA)表达而抑制端粒酶的活性、诱导癌细胞凋亡,可能是EPA的抗癌作用机制之一。     

桧木醇铁螯合物诱导乳腺癌细胞铁死亡机理研究

为了探讨Fe(hino)3诱导乳腺癌细胞铁死亡机理,本文研究了Fe(hino)3对乳腺癌细胞的增殖活性、细胞内亚铁离子含量、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量、细胞脂质过氧化变化和GSSG/GSH比值变化的影响;采用实时荧光定量PCR和Western blot研究了Fe(hino)3对乳腺癌细胞内Nrf2,HO-1, NQO1和Keap1基因和蛋白表达的影响,研究了纳米颗粒PLGA-Fe(hino)3对小鼠移植瘤增殖作用的影响.结果发现Fe(hino)3诱导乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF7/ADR细胞铁死亡,铁死亡抑制剂DFO, Fer-1, Lip-1可显著抑制Fe(hino)3诱发的细胞死亡;细胞内亚铁离子含量、MDA含量、ROS含量、GSSG/GSH比值与Fe(hino)3的作用时间和浓度成正比; Fe(hino)3上调Nrf2, HO-1和NQO1基因和蛋白的表达,下调Keap1蛋白的表达; PLGA-Fe(hino)3抑制了小鼠移植瘤的增殖, PLGA-Fe(hino)3给药...     

FOXQ1在肝癌中的临床意义及其对SMMC-7721细胞体外血管形成的影响

探讨叉头框蛋白Q1(forkhead box Q1, FOXQ1)基因在肝癌中的临床意义及对肝癌细胞体外血管生成作用.利用 qRT-PCR法及Western印迹法,检测24例肝癌、癌旁组织、正常肝细胞L02及肝癌细胞SMMC-7721中FOXQ1的mRNA和蛋白质的表达;利用免疫组织化学法检测68例肝癌及癌旁组织中FOXQ1的蛋白质表达.合成shRNA-FOXQ1及shRNA-NC慢病毒,转染到SMMC-7721细胞.用体外血管生成实验检测转染shRNA-FOXQ1的肝癌细胞血管生成能力. 用qRT-PCR和Western印迹法检测细胞间FOXQ1、VEGF基因和蛋白质的表达.结果显示,癌组织和SMMC-7721细胞中FOXQ1 mRNA和蛋白质的表达均高于癌旁组织和正常肝细胞(P<0.05),FOXQ1蛋白的表达与TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤数目、肿瘤大小等参数差异显著(P<0.05).shRNA-FOXQ1组血管生成能力明显低于shRNA-NC组和空白组(P<0.05),FOXQ1、VEGF基因和蛋白质的表达也明显低于shRNA-NC组和空白组(P<0.05).研究结果证实,FOXQ1在肝癌中高表达,如果沉默FOXQ1的表达可抑制肝癌细胞血管生成,与肝癌的临床病理特征密切相关.     

Redox Modulation and Induction of Ferroptosis as a New Therapeutic Strategy in Hepatocellular Carcinoma

Ferroptosis, a newly discovered form of cell death mediated by reactive oxygen species (ROS) and lipid peroxidation, has recently been shown to have an impact on various cancer types; however, so far there are only few studies about its role in hepatocellular carcinoma (HCC). The delicate equilibrium of ROS in cancer cells has found to be crucial for cell survival, thus increased levels may trigger ferroptosis in HCC.In our study, we investigated the effect of different ROS modulators and ferroptosis inducers on a human HCC cell line and a human hepatoblastoma cell line. We identified a novel synergistic cell death induction by the combination of Auranofin and buthionine sulfoxime (BSO) or by Erastin and BSO at subtoxic concentrations. We found a caspase-independent, redox-regulated cell death, which could be rescued by different inhibitors of ferroptosis. Both cotreatments stimulated lipid peroxidation. All these findings indicated ferroptotic cell death. Both cotreatments affected the canonical ferroptosis pathway through GPX4 downregulation. We also found an accumulation of Nrf2 and HO-1, indicating an additional effect on the non-canonical pathway. Our results implicate that targeting these two main ferroptotic pathways simultaneously can overcome chemotherapy resistance in HCC.     

GSTZ1 sensitizes hepatocellular carcinoma cells to sorafenib-induced ferroptosis via inhibition of NRF2/GPX4 axis

Increasing evidence supports that ferroptosis plays an important role in tumor growth inhibition. Sorafenib, originally identified as an inhibitor of multiple oncogenic kinases, has been shown to induce ferroptosis in hepatocellular carcinoma (HCC). However, some hepatoma cell lines are less sensitive to sorafenib-induced ferroptotic cell death. Glutathione S-transferase zeta 1 (GSTZ1), an enzyme in the catabolism of phenylalanine, suppresses the expression of the master regulator of cellular redox homeostasis nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2). This study aimed to investigate the role and underlying molecular mechanisms of GSTZ1 in sorafenib-induced ferroptosis in HCC. GSTZ1 was significantly downregulated in sorafenib-resistant hepatoma cells. Mechanistically, GSTZ1 depletion enhanced the activation of the NRF2 pathway and increased the glutathione peroxidase 4 (GPX4) level, thereby suppressing sorafenib-induced ferroptosis. The combination of sorafenib and RSL3, a GPX4 inhibitor, significantly inhibited GSTZ1-deficient cell viability and promoted ferroptosis and increased ectopic iron and lipid peroxides. In vivo, the combination of sorafenib and RSL3 had a synergic therapeutic effect on HCC progression in Gstz1^−/− mice. In conclusion, this finding demonstrates that GSTZ1 enhanced sorafenib-induced ferroptosis by inhibiting the NRF2/GPX4 axis in HCC cells. Combination therapy of sorafenib and GPX4 inhibitor RSL3 may be a promising strategy in HCC treatment.Subject terms: Cancer therapeutic resistance, Cancer therapeutic resistance     

Sigma‐1 receptor protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells

Sigma‐1 receptor (S1R) regulates reactive oxygen species (ROS) accumulation via nuclear factor erythroid 2‐related factor 2 (NRF2), which plays a vital role in ferroptosis. Sorafenib is a strong inducer of ferroptosis but not of apoptosis. However, the mechanism of sorafenib‐induced ferroptosis in hepatocellular carcinoma (HCC) remains unclear. In this study, we found for the first time that sorafenib induced most of S1Rs away from nucleus compared to control groups in Huh‐7 cells, and ferrostatin‐1 completely blocked the translocation. S1R protein expression, but not mRNA expression, in HCC cells was significantly up‐regulated by sorafenib. Knockdown of NRF2, but not of p53 or hypoxia‐inducible factor 1‐alpha (HIF1α), markedly induced S1R mRNA expression in HCC cells. Inhibition of S1R (by RNAi or antagonists) increased sorafenib‐induced HCC cell death in vitro and in vivo. Knockdown of S1R blocked the expression of glutathione peroxidase 4 (GPX4), one of the core targets of ferroptosis, in vitro and in vivo. Iron metabolism and lipid peroxidation increased in the S1R knockdown groups treated with sorafenib compared to the control counterpart. Ferritin heavy chain 1 (FTH1) and transferrin receotor protein 1 (TFR1), both of which are critical for iron metabolism, were markedly up‐regulated in HCC cells treated with erastin and sorafenib, whereas knockdown of S1R inhibited these increases. In conclusion, we demonstrate that S1R protects HCC cells against sorafenib and subsequent ferroptosis. A better understanding of the role of S1R in ferroptosis may provide novel insight into this biological process.     

沉默EVL表达抑制肝癌细胞SMMC-7721的增殖和迁移能力

Ena/VASP 样蛋白（Ena/VASP like protein,EVL）是Ena/VASP家族成员之一,它参与肌动蛋白细胞骨架重组,以及细胞迁移、收缩环形成和细胞间附着.EVL在肝癌SMMC-7721细胞中高表达. 抑制EVL蛋白表达后,SMMC-7721细胞的增殖与迁移能力降低.为研究EVL在肝癌细胞的功能,构建了靶向shRNA干扰表达载体,稳定转染肝癌SMMC-7721细胞. MTT实验和细胞集落形成实验显示,与转染对照比较,沉默EVL蛋白表达可明显抑制SMMC-7721肝癌细胞的增殖、集落形成能力. Transwell实验证明,沉默EVL表达导致SMMC-7721细胞迁移能力降低. 进而,流式细胞术揭示,沉默EVL表达的SMMC-7721细胞G0/G1期细胞比例增多.研究结果提示,EVL蛋白可促进肝癌细胞的增殖与迁移;该结果可解释EVL在肝癌细胞中高表达的意义.     

蛋白激酶PRKX对人肝癌细胞粘附和迁移能力的影响

目的观察蛋白激酶PRKX对人肝癌细胞SMMC-7721粘附和迁移能力的影响。方法采用脂质体转染的方法,将PRKX表达质粒转染到SMMC-7721细胞中,蛋白印迹方法鉴定转染前后PRKX蛋白的表达。细胞-基质粘附实验测定对照组和PRKX转染组SMMC-7721细胞的粘附能力。细胞迁移实验测定对照组和PRKX转染组SMMC-7721细胞的迁移能力。结果 SMMC-7721细胞转染组PRKX蛋白的表达增加,SMMC-7721细胞转染组的粘附能力和迁移能力均较对照组增加。结论 PRKX可增加人肝癌细胞SMMC-7721的粘附和迁移能力。     

SMMC-7721肝癌细胞67kD层粘连蛋白受体的分离纯化

分离纯化肝癌细胞的 6 7kD层粘连蛋白受体 (6 7LR) ,以便进一步研究 6 7LR的结构、功能及其在肝癌浸润、转移过程中的作用 .以SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞为材料 ,采用13 1I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力 ;亲和层析法分离纯化层粘连蛋白受体 ,用SDS PAGE、放射自显影及体外竞争结合实验进行鉴定 .在相同条件下SMMC 772 1肝癌细胞与层粘连蛋白特异结合量为 17 5 4± 0 4 9ng 10 5细胞 ,而L 0 2正常肝细胞与层粘连蛋白的特异结合量为 8 36± 0 4 8ng 10 5细胞 .经过亲和层析 ,从SMMC 772 1肝癌细胞和L 0 2正常肝细胞均可获得纯化受体 ,SDS PAGE显示为单一条带 ,分子量为 6 7kD ,放射自显影及体外竞争结合实验表明其具有较强的与层粘连蛋白结合的活性 .体外竞争结合实验表明 ,SMMC 772 1肝癌细胞层粘连蛋白受体 (772 1LnR)的抑制率可达到 96 2 7± 2 2 9% ,而L 0 2正常肝细胞层粘连蛋白受体 (L 0 2LnR)的抑制率为 4 8 71± 3 79% ,这说明 772 1LnR与层粘连蛋白的亲和力明显高于L 0 2LnR(P <0 0 0 1) .结果表明 ,与L 0 2肝细胞比较 ,SMMC 772 1肝癌细胞具有与层粘连蛋白较强结合能力的特异受体 ,并从肝癌细胞膜上分离纯化到与层粘连蛋白有较强亲和力的 6 7LR     

OIP5对肝癌细胞SMMC-7721增殖和侵袭迁移能力的影响

目的:探讨OIP5对肝癌细胞SMMC-7721增殖和侵袭迁移能力的影响。方法:采用RNA干扰技术沉默肝癌细胞中OIP5的表达后,通过qRT-PCR和Western-blot技术检测OIP5的下调效率,CCK-8和平板克隆法检测肝癌细胞的增殖能力,Transwell法检测肝癌细胞的侵袭和迁移能力。结果:转染OIP5-siRNA后,肝癌细胞SMMC-7721中OIP5 mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(P0.05);同时,与对照组相比,OIP5-siRNA组肝癌细胞SMMC-7721的CCK-8实验的OD值、平板克隆法测得的克隆球个数、Transwell法测得的迁移细胞数与侵袭细胞数均明显低于对照组(P0.05)。结论:OIP5能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭迁移,可能作为肝癌治疗的潜在靶点。