橡胶树热激蛋白HbHSP90.8-1基因的克隆与功能分析

白粉病是橡胶树生长发育过程中主要叶部病害之一。热激蛋白90（HSP90）分子伴侣在植物逆境胁迫抗性中起着重要作用。为研究HSP90家族成员结构及其在橡胶树抗白粉病中的功能,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397叶片中克隆HbHSP90.8-1并采用生物信息学等技术对其结构和功能进行分析。结果表明,HbHSP90.8-1 cDNA序列全长2 844 bp,开放阅读框（ORF）2 454 bp,编码817个氨基酸。HbHSP90.8-1编码一个有信号肽、无跨膜结构且定位预测在内质网上的稳定亲水蛋白,存在HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域。系统进化分析结果表明橡胶树HbHSP90.8-1与木薯MeHSP90的亲缘关系最近,与麻风树JcHSP90聚为一类。通过qRT-PCR分析结果表明HbHSP90.8-1在橡胶树不同组织中均有表达,其在胶乳中的表达量最高;HbHSP90.8-1基因在白粉菌侵染、H₂O₂、ABA和ETH处理叶片中,表达量均呈现显著上调趋势;在MeJA和SA激素处理下,HbHSP90.8-1表达量呈现下调的趋势。说明HbHSP90.8-1参与橡胶树对白粉菌响应过程以及植物抗病相关激素信号转导途径。     

bZIP转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长发育和致病力

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要病害之一,引起该病害的主要致病菌为果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola。本研究以果生刺盘孢菌bZIP类转录因子CfHac1为研究对象,研究其在果生刺盘孢菌的营养生长、产孢量、附着胞形成、致病力及耐受性等方面的生物学功能,为油茶炭疽病的防控提供理论依据。研究结果表明,果生刺盘孢菌中具有一个与灰色大角间座壳（稻瘟菌）bZIP转录因子MoHac1直系同源的基因,命名为CfHAC1。该基因全长1 627bp,编码526个氨基酸,该蛋白含有一个碱性亮氨酸链（bZIP）结构域和3个未知功能结构域。CfHAC1基因敲除突变体的菌丝生长速度显著变慢,分生孢子产量显著减少且不能正常形成附着胞,并对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加;致病力测试结果表明,果生刺盘孢菌基因敲除突变体ΔCfhac1对油茶的致病力显著下降。转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长、产孢、附着胞的形成、致病力以及响应外界渗透压胁迫过程。     

橡胶树胶乳高表达热激蛋白HbHSP90.4基因抗逆功能分析

为了分析热激蛋白90（HSP90）基因在橡胶树（Hevea brasiliensis）逆境胁迫和激素转导中的作用,利用PCR技术从橡胶树品种热研73397胶乳中克隆得到HbHSP90.4基因全长cDNA序列,该基因含有1个2 451 bp开放阅读框（ORF）,编码816个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbHSP90.4含有HSP90 superfamily和HATPase superfamily结构域,属于HSP90家族成员。系统进化分析发现该蛋白与木薯MeHSP90具有较近的亲缘关系。亚细胞定位预测显示HbHSP90.4基因定位在内质网。qRT-PCR结果表明HbHSP90.4基因主要在橡胶树胶乳中表达。干旱、冷胁迫、橡胶树白粉菌侵染、H₂O₂和MeJA处理均可促进胶乳HbHSP90.4基因上调表达,而其在ETH、SA和ABA处理中均呈现显著下调表达。构建植物表达载体HbHSP90.4-mScarlet,为进一步的转基因植物的做成准备了材料。本研究为阐明胶乳HbHSP90.4基因响应橡胶树逆境胁迫过程和植物激素信号传导途径分子调控机制奠定坚实基础。     

橡胶草TkAPC10基因的鉴定及其表达模式分析

APC/C是一类泛素连接酶E3复合体,在调控细胞周期过程中发挥重要作用。为了揭示橡胶草APC/C蛋白复合体的功能,鉴定了橡胶草TkAPC10基因,并对其表达模式进行了分析,初步确定了其功能。TkAPC10基因的ORF为579 bp,编码192个氨基酸,其基因组DNA序列为1 092 bp,包含6个外显子和5个内含子。基因组分析发现,TkAPC10以单拷贝的形式存在,其启动子序列除了含有TATA-box和CAAT-box增强子元件外,还有ABA、JA、光以及逆境响应相关的顺式作用元件。系统进化关系分析发现,不同物种的APC10蛋白具有很高的同源性,TKAPC10与莴苣LsAPC10的相似性最高达到99%,而与其他菊科植物的APC10蛋白相似性也达到95%以上。进一步采用qRT-PCR技术对TKAPC10的表达模式进行分析,结果表明,该基因在细胞分裂旺盛的组织（花、叶和根）中的表达量显著高于细胞分裂活动相对缓慢的组织（花梗）。外源ABA处理后,TKAPC10基因转录水平显著下降;而MeJA和ET处理后,该基因显著上调表达。经PEG6000以及甘露醇处理后,TKAPC10表达水平显著下降;而高盐胁迫显著诱导该基因的表达。TKAPC10基因参与橡胶草细胞分裂、激素信号以及非生物胁迫响应过程的调控。     

构树转录因子BpbZIP1的鉴定及镉胁迫响应分析

重金属污染不仅影响土壤有效面积,限制植被分布,也会对食物链和人体健康造成危害,其中镉（Cd）污染尤为突出。选择重金属耐受性强的植物应用于尾矿区的土壤修复亟待进行。构树（Broussonetia papyrifera）是重金属污染土壤的先锋树种,为探明构树响应重金属胁迫的分子机制,本研究从构树中克隆获得1个碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）转录因子（命名为BpbZIP1）,对其基本生物信息、Cd胁迫响应及转化酵母的功能进行分析,预测BpbZIP1响应Cd的功能。结果显示,BpbZIP1基因开放阅读框长1 713 bp,编码的蛋白含570个氨基酸,分子量为62 902.38 Da,等电点为4.62。与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtbZIP1具有较近的进化关系。在150 μmol·L^-1 CdCl₂处理下,BpbZIP1基因能被不同程度的诱导表达,在3 h时BpbZIP1在根中的表达为对照的17.4倍。将BpbZIP1转入酵母能显著提高转基因酵母的抗Cd能力,当浓度高于0.6%时,转基因酵母的生长活力是对照的1.54~1.71倍。以上结果表明BpbZIP1基因能积极响应Cd胁迫,其表达可改善Cd胁迫耐受力,是构树Cd胁迫响应的重要基因。     

小黑杨转录因子PsnbZIP1应答盐胁迫功能分析

为揭示小黑杨（Populus simonii × P. nigra）在面对非生物胁迫时,转录因子PsnbZIP1在植物体内发挥的功能,以小黑杨为试验材料,克隆得到PsnbZIP1的ORF区序列长为432 bp,并初步分析PsnbZIP1盐胁迫下的分子机制。采用q-PCR分析PsnbZIP1在150 mmol·L^-1 NaCl处理小黑杨组培苗时的表达模式,发现该基因的表达量快速上升;通过生物信息学分析预测PsnbZIP1转录因子为无跨膜结构且具有信号肽的亲水性不稳定蛋白;用农杆菌（Agrobacterium）介导的烟草（Nicotiana）瞬时表达观察该基因的亚细胞定位情况,结果表明该基因为核定位蛋白;用酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内不具有转录激活功能。对PsnbZIP1基因的启动子序列进行分析,结果表明该启动子包含了生长素应答、脱落酸应答元件、光应答元件以及种子特异性调控的顺式作用调控元件,该基因可能在植物的生长发育与响应胁迫过程中发挥了重要作用;启动子还包括参与干旱诱导的MYB结合位点和MYBHv1结合位点,表明该基因有可能与一些干旱诱导相关MYB基因相互作用。     

西红花FT同源基因的表达及功能分析

FT（FLOWERING LOCUS T）及其同源基因作为三大开花途径整合子之一,被认为是调控植物开花的重要基因。为了深入研究FT同源基因的功能以及西红花（Crocus sativus L.）开花的分子机理,对已报道的3个西红花FT同源基因（CsatFT1、CsatFT2和CsatFT3）进行分离及分析。gDNA包含长度分别为835、1 642和1 132 bp的完整开放阅读框（ORF）,均具有4个外显子和3个内含子;cDNA包含长度分别为528、525和540 bp的ORF,分别编码175、174和179个氨基酸;系统进化分析表明,CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3分别和同为单子叶植物的水仙（Narcissus chinensis）NtFT、麝香百合（Lilium longiflorum）LlFT和洋葱（Allium cepa）AcFT1表现出较近的遗传距离。qRT-PCR分析结果显示,小球茎膨大阶段前期,CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3在叶片中表达水平最高,侧根中次之,子球茎、主根中极低几乎检测不到;小球茎膨大阶段后期,CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3都在子球茎中表达水平较高,在顶芽中几乎检测不到;室内储藏开花阶段,CsatFT1、CsatFT2、CsatFT3在柱头中表达水平最高,叶中次之,花瓣和花药中较低几乎检测不到。通过观测转基因烟草（Nicotiana tabacum）和转基因拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株表型发现,CsatFT1,CsatFT2和CsatFT3均具有促进植物提早开花的功能。     

烟草乙烯转录因子ERF基因NtTOE3的克隆、载体构建及表达分析

ERF（Ethylene-responsive factor）是一类具有AP2特征结构域的乙烯应答转录因子,在响应植物的逆境胁迫应答中起关键作用。为明确ERF家族成员TOE3在烟草中的生物学功能和调控机制,同源克隆普通烟草K326中NtTOE3基因cDNA全长,利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对基因功能和调控机制进行初步预测。结果表明,该基因全长1 356 bp,编码451个氨基酸残基,预测分子量为49.84 ku。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水蛋白,可能定位在细胞核,且与美花烟草（Nicotiana sylvestris）NsTOE3有96%的同源性,故命名为NtTOE3。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中茎中表达量最高。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H₂O₂、ABA和4℃等逆境处理。表明NtTOE3转录因子在烟草非生物胁迫中起着重要调节作用。     

中国红豆杉TcNPR1基因的克隆与功能研究

水杨酸（SA）可诱导红豆杉细胞中紫杉醇的合成,病程相关基因非表达子基因（NPR1）是SA介导的植物系统获得性抗性（SAR）信号途径中的关键信号分子。本研究从中国红豆杉（Taxus chinesis）细胞中克隆了TcNPR1基因,该基因完整的开放阅读框大小为1857 bp,编码蛋白序列由619个氨基酸组成,含有典型的NPR1保守结构域、锌指结构域和锚蛋白结构域。进化树分析发现,TcNPR1蛋白与拟南芥AtNPR3和AtNPR4类蛋白的亲源关系较近。TcNPR1基因表达响应SA、干旱和NaCl胁迫处理,且随着处理时间增加,TcNPR1基因表达量逐渐增大。超表达TcNPR1的转基因烟草植株对干旱的耐受力增强,叶片内可溶性糖含量达43.8 mg/g（FW）,比对照高出2倍左右,说明TcNPR1基因具有表达功能,此结果为探究中国红豆杉细胞响应SA诱导大量合成紫杉醇的信号途径提供了依据。     

木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究

MYC2（MYeloCytomatosis）转录因子是植物应对逆境胁迫过程中茉莉酸信号传导相关的核心转录因子。本研究旨在初步分析木薯MeMYC2.2基因在低温胁迫响应中的功能。利用生物信息学分析木薯MeMYC2.1和MeMYC2.2基因的结构及其编码蛋白的理化性质;通过定量PCR分析了上述2个基因在木薯组培苗叶片中对低温胁迫的响应;通过转基因拟南芥研究MeMYC2.2的抗冻功能。木薯组培苗叶片中2个MeMYC2基因的表达均在低温胁迫早期被诱导,其中,与MeMYC2.1相比,MeMYC2.2差异表达更显著。MeMYC2.2蛋白主要定位于细胞核中,且在酵母中具有明显转录自激活功能,表明该蛋白具有转录因子特性。与野生型相比,过表达MeMYC2.2的转基因拟南芥抗冻能力显著提高。在低温处理下,CBF3基因在转基因拟南芥中的表达量要明显高于其在野生型的表达量,但另外3个CBF基因在转基因拟南芥中的表达量明显下降。木薯MeMYC2.2的表达受低温和茉莉酸调控,可以提高植物的抗冻性,且可能影响CBF基因对低温的响应。本研究为进一步利用MeMYC2基因改良木薯的低温耐受性奠定了理论基础。     

Evidence for an Important Role of WRKY DNA Binding Proteins in the Regulation of NPR1 Gene Expression

The Arabidopsis NPR1 gene is a positive regulator of inducible plant disease resistance. Expression of NPR1 is induced by pathogen infection or treatment with defense-inducing compounds such as salicylic acid (SA). Transgenic plants overexpressing NPR1 exhibit enhanced resistance to a broad spectrum of microbial pathogens, whereas plants underexpressing the gene are more susceptible to pathogen infection. These results suggest that regulation of NPR1 gene expression is important for the activation of plant defense responses. In the present study, we report the identification of W-box sequences in the promoter region of the NPR1 gene that are recognized specifically by SA-induced WRKY DNA binding proteins from Arabidopsis. Mutations in these W-box sequences abolished their recognition by WRKY DNA binding proteins, rendered the promoter unable to activate a downstream reporter gene, and compromised the ability of NPR1 to complement npr1 mutants for SA-induced defense gene expression and disease resistance. These results provide strong evidence that certain WRKY genes act upstream of NPR1 and positively regulate its expression during the activation of plant defense responses. Consistent with this model, we found that SA-induced expression of a number of WRKY genes was independent of NPR1.     

Uncoupling PR gene expression from NPR1 and bacterial resistance: characterization of the dominant Arabidopsis cpr6-1 mutant.

In Arabidopsis, NPR1 mediates the salicylic acid (SA)-induced expression of pathogenesis-related (PR) genes and systemic acquired resistance (SAR). Here, we report the identification of another component, CPR 6, that may function with NPR1 in regulating PR gene expression. The dominant CPR 6-1 mutant expresses the SA/NPR1-regulated PR genes (PR-1, BGL 2, and PR-5) and displays enhanced resistance to Pseudomonas syringae pv maculicola ES4326 and Peronospora parasitica Noco2 in the absence of SAR induction. cpr 6-1-induced PR gene expression is not suppressed in the cpr 6-1 npr1-1 double mutant but is suppressed when SA is removed by salicylate hydroxylase. Thus, constitutive PR gene expression in cpr 6-1 requires SA but not NPR1. In addition, resistance to P. s. maculicola ES4326 is suppressed in the cpr 6-1 npr1-1 double mutant, despite expression of PR-1, BGL 2, and PR-5. Resistance to P. s. maculicola ES4326 must therefore be accomplished through unidentified antibacterial gene products that are regulated through NPR1. These results show that CPR 6 is an important regulator of multiple signal transduction pathways involved in plant defense.     

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建

NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因。该文以DNA PCR扩增的方法,从拟南芥基因组DNA中克隆出NPR1基因,通过序列分析,所克隆的 NPR1 基因与报道的基因序列完全一致。将其构建成植物表达载体,为今后植物抗病基因工程的开展奠定了基础。     

Multiple roles of WIN3 in regulating disease resistance, cell death, and flowering time in Arabidopsis

The salicylic acid (SA) regulatory gene HOPW1-1-INTERACTING3 (WIN3) was previously shown to confer resistance to the biotrophic pathogen Pseudomonas syringae. Here, we report that WIN3 controls broad-spectrum disease resistance to the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea and contributes to basal defense induced by flg22, a 22-amino acid peptide derived from the conserved region of bacterial flagellin proteins. Genetic analysis indicates that WIN3 acts additively with several known SA regulators, including PHYTOALEXIN DEFICIENT4, NONEXPRESSOR OF PR GENES1 (NPR1), and SA INDUCTION-DEFICIENT2, in regulating SA accumulation, cell death, and/or disease resistance in the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) mutant acd6-1. Interestingly, expression of WIN3 is also dependent on these SA regulators and can be activated by cell death, suggesting that WIN3-mediated signaling is interconnected with those derived from other SA regulators and cell death. Surprisingly, we found that WIN3 and NPR1 synergistically affect flowering time via influencing the expression of flowering regulatory genes FLOWERING LOCUS C and FLOWERING LOCUS T. Taken together, our data reveal that WIN3 represents a novel node in the SA signaling networks to regulate plant defense and flowering time. They also highlight that plant innate immunity and development are closely connected processes, precise regulation of which should be important for the fitness of plants.     

Salicylic acid and systemic acquired resistance play a role in attenuating crown gall disease caused by Agrobacterium tumefaciens

We investigated the effects of salicylic acid (SA) and systemic acquired resistance (SAR) on crown gall disease caused by Agrobacterium tumefaciens. Nicotiana benthamiana plants treated with SA showed decreased susceptibility to Agrobacterium infection. Exogenous application of SA to Agrobacterium cultures decreased its growth, virulence, and attachment to plant cells. Using Agrobacterium whole-genome microarrays, we characterized the direct effects of SA on bacterial gene expression and showed that SA inhibits induction of virulence (vir) genes and the repABC operon, and differentially regulates the expression of many other sets of genes. Using virus-induced gene silencing, we further demonstrate that plant genes involved in SA biosynthesis and signaling are important determinants for Agrobacterium infectivity on plants. Silencing of ICS (isochorismate synthase), NPR1 (nonexpresser of pathogenesis-related gene 1), and SABP2 (SA-binding protein 2) in N. benthamiana enhanced Agrobacterium infection. Moreover, plants treated with benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid, a potent inducer of SAR, showed reduced disease symptoms. Our data suggest that SA and SAR both play a major role in retarding Agrobacterium infectivity.