用固定化中间埃希氏菌细胞合成L-酪氨酸

将中间埃希氏茵(Esherichia intermedia)细胞包埋在聚丙烯酰胺凝胶中,应用于从酚、丙酮酸和氨酶促合成L-酪氨酸。含50mg细胞/g凝胶的制剂保留原酶活性的60%。温度、pH和底物浓度对游离细胞和固定化细胞的影响几乎相同。高浓度的酚将使催化剂受到抑制和失活。在分批反应器中证实,L-酪氨酸的生物合成(10g/1以上)具有高转化率(95—100%)和最高产率(2g/l/hr)。在连续反应器里,催化剂显示出很高的操作稳定性(超过54天)。     

用生物反应器生产L-氨基酸

现已有几种L-氨基酸是用生物反应器中的酶或全细胞生产的。最早采用这种技术的例子之一是日本L-天冬氨酸的生产。最近放大了由肉桂酸和氨生产L-苯丙氨酸的生物反应器法,产物效价达60克/升以上,原料转化率约为90％。     

通过谷氨酸棒状杆菌由α-酮异已酸生产L-亮氨酸的微生物生产法

本文研究用谷氨酸棒状杆菌(Co-rlnebacterium glutamicum)将α-酮异巳酸转化为L-亮氨酸的生产过程。在α-酮异已酸的浓度为20克/升的培养基中,经57小时的发酵大约有16克/升的L-亮氨酸被合成,其克分子产量为91%。若采用流加补料分批培养法时,在23小时内就可能从32克/升的α-酮异巳酸中产生出24克升的L-亮氨酸。有关的酶学研究表明,在这种谷氨酸生产菌中a酮异巳酸是经过转氨酶B的作用被转化为亮氨酸的。转氨作用所需的L谷氨酸则通过谷氨酸脱氨酶的作用再生。α-酮异巳酸加入培养基中后,转氨酶B的比活性提高三倍。     

固定化生长酵母连续生产酒精的研究中间试验报告

造粒器与柱式生物反应器成—封闭系统,采用正交试验确定的最适固定化条件,以海藻酸钙凝胶法进行细胞固定化,连续造粒,在反应器中完成固定化。固定化酵母在反应器中通气培养20小时左右,凝胶球细胞数达2×10~9/me,其增长速度比传统工艺自然细胞快10倍。固定化生长细胞用于生物反应器连续发酵甜菜糖蜜酒精,酒精生产能力为22.1—23.67g/L凝胶球/小时,为传统工艺酒精生产能力的10倍。停留时间为3小时。反应器系统由两个0.7KL柱式反应器和1个0.8KL成熟醪接收器组成。发酵周期由传统工艺的20小时左右,缩短为4小时,酒精含量为8.5—9.0％(V/V),对1.2号反应器的动态变化及其在发酵中的作用进行了系统研究,糖蜜中可发酵糖75％的转化是在1号反应器中完成的。     

不产山梨糖醇副产物的乙醇发酵

不产山梨糖醇的运动单孢菌(Zymomonas mobilis)ACM3963是由Z.mobilis UQM2716获得的。将本菌与转化酶共同固定在草朊酸盐中并在以蔗糖为底物的培养基中培养。采用这种共同固定方法,使用半规定培养基(semi-defined media)和甜糖浆所产乙醇的理论莱收率分别可达100和150克/升蔗糖。在这两种发酵中均不生成山梨糖醇或果糖-寡糖。在草朊酸盐中固定的菌体浓度提高可使100和150克/升糖蔗的发酵时间缩短50～70％,分别为3和5小时。此菌株也改善了蔗糖补料间歇发酵的效率。     

己酸菌和产酯酵母共固定产己酸乙酯的研究

用吸附包埋法将己酸菌和产酯酵母共固定在海藻酸钙棉纤维上,在帘式生物反应器中进行分批式发酵。最适ｐＨ为６.５,温度３０～３５℃。经过共固定１０批发酵,历时１００ｄ,凝胶的稳定性良好,己酸乙酯产量也稳定在１.９～２.３ｍｇ／ｍｌ之间,经对比试验证明,用共固定法合成己酸乙酯比游离细胞混菌发酵法产量提高约２２％。     

重组大肠杆菌高效催化合成γ-氨基丁酸

[目的]实现重组大肠杆菌高效合成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。[方法]构建表达谷氨酸脱羧酶的基因工程菌Escherichia coli p ET-GAD,对催化工艺进行初步优化,实现高效催化L-谷氨酸脱羧反应合成GABA。[结果]在谷氨酸脱羧酶的表达过程中,维生素B6盐酸吡哆醇(PN)可以替代5-磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶补给,提高工程菌E. coli p ET-GAD的催化活力。在50 m L反应体系中,重组细胞浓度为8 mg/m L,底物浓度为200 mmol/L,在35℃、p H 4. 4条件下反应2 h,L-谷氨酸的转化率 98%。为了提高GABA的生产效率,采用谷氨酸/谷氨酸钠分批补料方式控制反应过程中的p H值,GABA的最终浓度达到247 g/L。[结论]重组大肠杆菌可以高效催化合成γ-氨基丁酸,为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。     

非水相脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的研究Ⅰ

对催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯反应的脂肪酶(NOVO435、MML、LIPOLASE、PPL)和反应介质进行比较,得出最佳酶种为NOVO435,最佳介质为叔戊醇;同时对影响合成L抗坏血酸棕榈酸酯反应的初速度的因素(转速、温度、水分含量、酶浓度和底物浓度)进行了探讨,确定了最适反应条件：转速为200r/min,温度为55℃,水分含量为0,酶浓度为12.5%。     

固定化嗜热脂肪芽孢杆菌连续合成半乳糖寡糖的研究

利用固定了产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌,以乳糖为底物,在纤维床反应器中连续合成半乳糖寡糖(GOS),最高得率为50.7%。在连续反应体系中,研究了底物浓度、pH、反应温度和停留时间对半乳糖寡糖合成的影响,确定最佳反应条件为底物浓度450 g/L、反应温度55℃、pH7.0、停留时间100 min。在连续反应24h后,流加1.5%的D-半乳糖能提高合成GOS的能力,固定化细胞反应体系中连续稳定操作120 h。     

由D、L-苯丙乳酸盐消旋混合物酶法生产L-苯丙氨酸

本文研究了在酶膜反应器中由D.L苯丙乳酸盐消旋混合物生产L-苯丙氨酸。反应的第一步消旋混合物在羟基异己酸脱氢酶作用下,脱氢生成本丙酮酸;第二步苯丙酮酸在苯丙氨酸脱氨酶作用下,还原胺化成L-苯丙氨酸。从化学计量来看,上述两步反应均需要辅酶参加。第一步需要NAD,第二步需要NADH,在此反应中,辅酶可以直接再生而起到催化作用。由于铺酶被共价结合到聚乙二醇—2000上,所以铺酶就类似于其它三种酶一样保留在反应器中。为了由D.L-本丙乳酸盐能不断连续地生产L-苯丙氨酸,我们设计了反应动力学及反应器体系模型。按照上述模型,我们可以计算出反应器中三种酶的最适比率,辅酶的最适浓度,以及投料中苯丙酮酸的最适浓度。采用这一程序,我们用底物浓度为50mM D.L-苯芮乳酸盐,可获得28克/升L-苯丙氨酸。     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

固相E.Coli细胞管在L-苏氨酸分析中的应用

具有增进生物降解L-苏氨酸脱氨酶水平丙酮干燥细胞,容易而牢固地用乳胶型—光-交联树脂前聚合物固定于玻璃管内壁。用此微生物细胞管的连续流动系统,证明适合于分析发酵液中的L-苏氨酸或L-丝氨酸,并具有快速(每次分析<9分钟)、底物专-性极好(专-L-苏氨酸或L-丝氨酸)以及经重复分析(至少60次)还非常稳定等特点。本文讨论应用具有L-苏氨酸脱氨酶性的大肠杆菌细胞管对L-苏氨酸进行分光光度计分析。     

利用丝氨酸羟甲基转移酶和β-酪氨酸酶偶联反应合成L-酪氨酸

本文研究了在5‘-磷酸吡哆醛和四氢叶酸存在条件下,通过丝氨酸羟甲基转移酶和β-酪氨酸酶偶联反应,由甘氨酸、甲醛和酚合成L-酪氨酸的反应条件。重组产气克雷伯氏菌菌株(Klebsiella aerogenes)和草生欧文氏菌(Erwinia her-hicola)(ATCC21434)分别为丝氨酸羟甲基转移酶和β-酪氨酸酶的来源。加入到反应器中的酚和甲醛的量根据反应的需求,应以这些化合物使酶失活降低到最小为准。高浓度的四氢叶酸用来与甲醛形成复合物。整个反应的最适pH为7.0左右,在这个pH范围内甘氨酸对β-酪氨酸酶的抑制作用最小。由于相同原因,有意思地维持甘氨酸的初始浓度在较低水平。反应混合物(500ml)含0.25M甘氨酸,0.5mM 5’-磷酸吡哆醛,0.056Mβ巯-基乙醇,7mM甲氢叶酸及初始酚浓度0.32%,细胞于pH7.0,37℃培养。加入37%的甲醛使反应开始。酚和甲醛的浓度和添加比例应经常检查和调整。反应6小时后的,L-酪氨酸产率77.3%(26.3克/升),甘氨酸转化率6.4%。     

氨甲酰磷酸不同合成途径在大肠杆菌中的比较

【背景】氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质,在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。【目的】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。【方法】在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上,分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPSⅡ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPSⅡ的催化反应进行优化。【结果】在大肠杆菌中过表达OTC,建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK,发现大肠杆菌来源的CK效果最好,50mmol/LNH4HCO3条件下全细胞催化9h得到2.95±0.15mmol/LL-瓜氨酸;过表达CPSⅡ时,50mmol/LL-谷氨酰胺催化9h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPSⅡ的催化反应分别进行优化后,100 mmol/L NH4HCO3条件下,L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55mmol/L和6.12±0.38mmol/L,且过表达GS后CPSⅡ途径可以利用NH3,不需要额外添加L-谷氨酰胺。【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPSⅡ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。     

红花愈伤组织诱导、生长及其α-生育酚的产生

通过TLC和HPLC初步分析和鉴定,证明从红花(Carthamus tinctorius)无菌苗的胚根、胚轴及子叶和花蕾中诱导出的愈伤组织均具有合成α-生育酚的能力。其中以胚轴的愈伤组织和悬浮培养细胞的生长速率及α-生育酚的含量较高,分别达到0.35、0.39克干重/升·天和0.62、2.28毫克/100克干重样品。对红花细胞生长较适宜的培养基为MC培养基。培养基中附加10％椰子汁或0.1％酪蛋白氨基酸可使细胞生长显著提高,分别达到0.45和0.41克干重/升·天。     

螺旋藻连续培养与动力学模型

在内循环气升式光生物反应器中 ,研究了钝顶螺旋藻 (SpirulinaplatensisGeitler)细胞的连续生长及其对碳源底物的利用特性。结果表明 :随着稀释率的增大 ,反应器中碳源浓度和细胞浓度分别呈上升和下降趋势 ,它们之间的关系可用Monod类型的方程很好地加以关联。细胞产率和碳消耗速率与稀释率的关系存在峰值现象 :在本实验条件下 ,最大细胞产率为 0 .36 2g/(L·d) ,最大碳消耗速率为 0 .177g/(L·d) ,此时稀释率为 0 .45 /d ,细胞浓度为OD560 =1.2 82 ,细胞对碳的得率系数为 2 .0 5 0g/g。所提出的连续培养动力学模型与实验数据拟合较好     

原位吸附浸没式膜生物反应器催化制备茚二醇

在浸没式膜反应器(IMB)中利用恶臭假单胞菌ATCC 55687催化茚制备顺式茚二醇。采用25根膜丝制作的膜组件,在茚为3 g/L时,经过24 h培养,IMB中顺式茚二醇产量达到悬浮细胞反应器(SCB)的4倍多;进一步,在培养开始阶段加入10 g/L sp-207树脂进行原位吸附,IMB中顺式茚二醇产量最高达709 mg/L,为SCB产量的660%,容积产率也从SCB中的6 mg/(L·h)提高到30 mg/(L·h)。在原位吸附IMB中,中空纤维膜既可作为固定化细胞载体,同时又可作为第二相吸附不溶性底物,降低底物和产物抑制,兼有固定化反应器和两相反应器的优点。     

多巴脱羧酶及其与神经类疾病的关联性研究进展

多巴脱羧酶(dopa decarboxylase,DDC)又称作芳香族L-氨基酸脱羧酶,是儿茶酚胺生物合成途径中重要的酶之一,具有多种生物学功能。多巴脱羧酶可分别催化L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-多巴)和L-5-羟色氨酸合成两种神经递质多巴胺和五羟色胺。多巴胺和五羟色胺在脊椎动物和无脊椎动物的生殖、发育、行为和免疫应答过程中均具有重要作用。此外,它还与多种神经类疾病和社会行为有关。多巴脱羧酶一般以二聚体的形式存在于哺乳类和昆虫的多种神经和非神经组织中。本文从多巴脱羧酶的结构、催化机制、与神经类疾病及其攻击性社会行为的关联性研究进展等方面进行了综述。     

酮古龙酸菌WB0104中L-山梨糖脱氢酶的分离和性质研究

从两步法生产维生素C重要前体2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-gulonic acid, 简称2-KLGA)的第二步转化菌酮古龙酸菌Ketogulonigenium sp.WB0104的细胞质中,经SP- Sepharose Fast Flow、DEAE-CL6B和凝胶过滤的方法,分离到了L-山梨糖脱氢酶(L-Sorbose Dehydrogenase , 简称SDH),质谱测定该酶分子量为60.499kd,而用凝胶过滤法测定其分子量为139.053±4.96kd,由此推测该酶为具有两个相同亚基的二聚体;辅基分析表明SDH含有辅基pyrroloquinoline quinone(PQQ).以L-山梨糖(L-Sorbose)为底物,2, 6-Dichlorophenolindophenol(DCIP)为电子受体,SDH具有明显的脱氢酶活性;以L-Sorbose为底物的Km值为23.94mmol/L.在无细胞体系中,在phenazine methosulfate (PMS)存在的情况下,SDH能将底物L-Sorbose直接转化为2-KLGA.     

固定化生长酵母连续生产酒精的研究

采用固定化生长细胞方法,以柱式生物反应器连续发酵甜菜糖蜜酒精。酒精能力为39.45g/L凝胶/h,停留时间1.8小时。生物反应器具有良好的稳定性,连续工作50天,发酵醪酒精含量在8.5％(v/v)以上。系统研究了最适固定化条件,用L_(16)(4~5)正交试验确定了最佳发酵条件。