pIRES2-GDNF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定(英文)

目的:采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-NT-3。方法:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3是采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP.神经营养素3 cDNA片段通过替换EGFP的方式插入到pIRES2-GDNF-EGFP中构建成为pIRES2-GDNF-NT-3双基因共表达载体。结果:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。结论:人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础。     

pIRES2-GDNF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定

目的：采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-NT-3。方法：人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3是采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP．神经营养素3cDNA片段通过替换EGFP的方式插入到pIRES2-GDNF-EGFP中构建成为pIRES2-GDNF-NT-3双基因共表达栽体。结果：人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。结论：人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础。     

人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定

目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.     

人HCN2 真核表达载体的构建及在HEK293 细胞中的表达

目的:构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞(HEK293)中的表达情况。方法:对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切(XhoI和BamHI)装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果:测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论:成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

人HCN2真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建含有人HCN2基因的真核表达载体,并观察在人胚胎肾细胞（HEK293）中的表达情况。方法：对人HCN2基因全序列进行分析,进行oligo设计,通过PCR,扩增HCN2全长cDNA,通过双酶切（XhoI和BamHI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染入HEK293细胞中,利用真核表达载体中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,对转染效率进行监测,采用反转录-聚合酶链反应检测HCN2 mRNA表达,全细胞膜片钳技术检测HCN2通道电流。结果：测序及酶切结果表明HCN2基因正确,荧光显微镜下,转染细胞观察到绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN2 mRNA表达,膜片钳检测到hHCN2基因编码的通道电流。结论：成功地构建了HCN2真核表达载体并进行了起搏通道HCN2基因的异源性表达。     

2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达

构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组（P〈0.05）。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。     

人Cuedc2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建人Cuedc2的真核表达载体,并进行体外验证。方法:提取人卵巢癌细胞总RNA,通过RT-PCR的方法其反转录为cDNA;以之为模板,利用PCR获得Cuedc2的编码区,纯化后克隆入pcDNA3.1myc-his(-),利用菌落PCR及DNA测序进行鉴定。最后,采用瞬时转染的方法,将所构建的重组CUEDC2真核表达载体通过脂质体转染HEK293细胞,48h后通过western blot检测Cuedc2蛋白的表达。结果:Cuedc2编码区cDNA正确地插入真核表达载体pcDNA3.1myc-his(-)中,western blot检测证实其在HEK293细胞中表达,而空载体转染的细胞为阴性,表明所构建的pcDNA3.1myc-his(-)-Cuedc2能够在体外有效表达。结论:本研究成功地克隆了人Cuedc2 cDNA,构建了重组真核表达载体,并在HEK293细胞中有效表达,为进一步研究人Cuedc2的功能及其与肿瘤的关系奠定了实验基础。     

PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用

为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ~(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1的构建及鉴定

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因Nurr1的真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1,并检测其在293T细胞中的表达。方法:采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从大鼠黑质中获取Nurrl基因,连接T载体测序正确后与真核空载体pIRES2-EGFP一起,经Nhe1和Xho1双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pIRES2-EGFP-Nurr1;真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1测序正确后采用脂质体法将其转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察转染效率,PCR检测Nurr1基因mRNA水平的表达情况,免疫印迹试验(Western Blot)检测Nurr1蛋白的表达水平。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1;293T细胞转染pIRES2-EGFP-Nurr1后可以高度表达绿色荧光,有效转录Nurr1基因并正确的高表达Nurr1蛋白。结论:成功构建Nurr1真核表达载体且在293T细胞中高水平表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),基因治疗帕金森病奠定基础。