重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷

2-O-α-D-甘油葡糖苷是一种在食品、化妆品、保健品及医药领域有着重大应用前景的高附加值产品,但国内仍未实现2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产,且鲜有关于2-O-α-D-甘油葡糖苷合成的相关报道。文中旨在开发一种利用食品安全级重组枯草芽孢杆菌全细胞催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的方法,通过构建一株异源表达肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶 (Sucrose phosphorylase,SPase) 的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168/pMA5-gtfA,并将其用作全细胞催化剂合成2-O-α-D-甘油葡糖苷,通过优化培养温度、时间及全细胞转化条件,提高其转化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的产量。结果表明,重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 168/pMA5-gtfA在30 ℃下培养20 h,菌体裂解物酶活力最大达1.43 U/mL,并且在1 mol/L蔗糖、2.5 mol/L甘油、pH 7.0、菌体OD600为40、30 ℃下全细胞转化反应48 h,共生成2-O-α-D-甘油葡糖苷189.3 g/L,平均转化速率为15.6 mmol/(L·h),蔗糖转化率约为75.1%,是目前报道的利用重组枯草芽孢杆菌催化合成2-O-α-D-甘油葡糖苷的最高产量,这为2-O-α-D-甘油葡糖苷的工业化生产及应用奠定了理论和实验基础。     

β-环糊精葡基转移酶的纯化方法及酶学性质的研究

β-环糊精葡基转移酶的粗酶液应用酚酞分光光度法测得该酶的环化活性为11.79U/mL。该粗酶液先经过淀粉-酒精沉淀或淀粉-硫酸铵沉淀初步纯化,然后经Sephacryl S-100凝胶层析后,比活力分别提高了16、21、50倍,由原来的11.44U/mg蛋白质增加到572.67U/mg蛋白质,回收率分别为72.4%、66.4%、40.9%,经SDS-PAGE电泳显示为单一的蛋白带,酶的分子量约为70kDa。酶学性质研究表明该酶的最适pH和最适温度分别为6.0和60℃,在pH6.0~10.0范围内,55℃以下保温30min基本保持稳定。纯化后的β-环糊精葡基转移酶的环化活性每克相当于35727U。     

副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究 *

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501 β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86.63kDa和675.56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6.5。 Mg ²⁺和Ca ²⁺对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu ²⁺几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的K_m和V_max分别为1.44mmol/L和58.32mmol/(L·s),催化系数k_cat为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501 β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。     

共表达N-乙酰转移酶提高Aspergillus nidulans α-葡糖苷酶在毕氏酵母中的表达研究

葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P. pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22. 56U/ml和0. 52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1. 92倍和1. 27倍。在此基础上进行3. 6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128. 12U/ml和1. 81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1. 96倍和1. 50倍。     

亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性

通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率。首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体。研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5%。对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间。模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。     

蔗糖磷酸化酶全细胞催化AA-2G的条件优化

目的:使用表达蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7,Sucrose phosphorylase,SPase)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-spase,作为全细胞催化剂,合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(Ascorbic acid 2-glucoside,AA-2G)。通过反应条件的优化研究,提高AA-2G的收率。方法:分别考察菌体量、缓冲液pH、蔗糖浓度、维生素C浓度、反应时间和温度对AA-2G合成反应的影响,再组合上述最佳条件进行反应。AA-2G的产量使用高效液相色谱法进行定量。结果:最佳反应条件为:菌体量15 mg/mL,缓冲液pH 4.5,蔗糖浓度100 g/L,维生素C浓度175 g/L,反应时间20 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G产量达到了35.7 g/L。结论:以蔗糖为底物,使用SPase合成AA-2G的研究报道较少。本研究通过优化此方法的反应条件,让AA-2G的产量得到了大幅提高。同时本研究中成功地采用了大肠杆菌工程菌作为全细胞催化剂,这比传统的使用粗酶液的方法更省时省力,有良好的应用潜力。     

发酵生产魔芋葡甘聚糖酶

目的:探索和了解发酵生产葡甘聚糖酶的最佳条件。方法:在 5L发酵罐上测定不同温度、pH和接种量对发酵的影响,并用正交试验筛选最佳的产酶条件配伍。结果:该菌产生葡甘聚糖酶的条件为接种量 1 0 %,通气量 2 0L h,发酵的前 1 6h温度为 40℃,搅拌速度 2 0 0r min,pH 7 0左右,之后温度调至 5 0℃,搅拌速度 1 0 0r min,pH调至 6. 0左右,添加 0 . 2 5 %的豆油做消泡剂。在这个条件下发酵获得的酶比活力可达 5 0 0 9U mg,总活力达到 1 0 81 9U ml。     

酶法合成2-氧-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)条件的研究

采用单因素优化法对环糊精葡萄糖苷转移酶(CGTase)合成糖基抗坏血酸(AA-2G)条件进行优化,AA-2G的产量为2.76 g/L,比未优化前0.46g/L提高了500%。再采用响应面法对AA-2G合成条件进行优化。由Plackett-Burman法筛选出三个主要因素为:pH、V_C和麦芽糊精浓度;由最陡爬坡实验得出最佳响应面区域;最后由Box-Behnken实验,得到最优条件为:pH 5.51,V_C36.16g/L,麦芽糊精28.54 g/L,转化时间24 h,温度37℃。在此条件下,AA-2G的理论产量为3.15 g/L,通过验证实验,得出AA-2G的产量为3.13 g/L,与预测的理论值接近,比单因素优化的结果(2.76g/L)提高了14%。     

副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei) TK1501β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86. 63kDa和675. 56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6. 5。Mg~(2+)和Ca~(2+)对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu~(2+)几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的K_m和V_(max)分别为1. 44mmol/L和58. 32mmol/(L·s),催化系数k_(cat)为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。     

特异腐质霉葡糖化酶催化生淀粉一步糖化的酶学特征

从北京西郊森林土壤中分离到产生糖化生淀粉的葡糖化酶的特异腐质霉Humicola insolens HG‐618菌株。优化的产酶培养基如下:6%麦麸、2%玉米粉、0.7%磷酸氢二铵和1%玉米浆,p H 8.0,250m L三角瓶装40m L培养基,在40℃和280r/min培养90h。以生玉米淀粉为底物,发酵液中葡糖化酶活力为180U/m L。酶学性质试验表明,该酶的最适反应p H为6.0,最适反应温度为65℃;在p H 6.0–9.0范围酶活力稳定;酶热稳定性强,在60℃和p H 6.0保温8h,酶活力仍保留83%。一步糖化生玉米粉试验表明,在50m L 30%浓度生玉米粉浆和270U HG‐618葡糖化酶的反应体系中,采用自然p H 6.7,在55℃和100r/min条件下糖化40h。获得的糖化液还原糖浓度为17.1%(由酶产生的还原糖浓度为15.9%),生玉米粉中所含淀粉的糖化率为90%,且产生的糖全部为葡萄糖。因此,该葡糖化酶具有良好的一步糖化生玉米粉前景,它也可以用于生大米粉、生小麦粉和生马铃薯粉的直接糖化。     

人直肠癌β-葡糖苷酶同工酶的动力学研究

 本文对人直肠癌及癌旁组织(对照)的β-葡糖苷酶同工酶的分离、底物动力学和某些物质的影响做了初步探索。结果表明:在这两种组织中分别存在三种同工酶。一种是胞液酶,Km值为1.18mmol/L(对照为1.13mmol/L),受NaCl和抗癌药WB非竞争性抑制;第二种是溶酶休可溶性酶,Km值为2.38mmol/L(对照为2.94mmol/L),不受NaCl影响,受WB的混合型抑制,直肠癌此酶受顺铂的竞争性抑制;第三种是溶酶体膜结合酶,受NaCl激活,使底物动力学由负协同性酶变为米氏酶。肿瘤组织中三种同工酶活性均高于癌旁组织中相应的酶活性。     

环糊精葡萄糖基转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

摘要:【目的】将环状芽孢杆菌251(Bacillus circulans 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase)展示在酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G),以提高AA-2G 的产量。【方法】将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒pYD1中的a凝集素(a-agglutinin)Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒pYD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-pYD1-cgt,对发酵条件(培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度)进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况。【结果】展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25 ℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/mL;表面展示CGTase 40 ℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,pH稳定范围变宽。对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适pH分别为30 ℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37%。【结论】对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景。     

溶葡球菌酶的纯化和某些性质

1.应用本实验室构建的克隆菌株枯草杆菌0044进行了溶葡球菌酶的发酵生产,产量为150—200mg/L; 2.通过DEAE-纤维素,CM-纤维素和Sephadex G-50层析纯化了该酶;并以NaCl盐析方式,首次获得了该酶结晶; 3.测定了溶葡球菌酶的某些性质; 4.观察并讨论了溶葡球菌酶与溶菌酶等在溶菌作用上的相互加强。     

生物转化法生产2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究进展

介绍了利用生物转化法合成L-抗坏血酸新型衍生物2-O-α-D-吡喃型葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的生产方法及其分离纯化方法,并对AA-2G的应用前景进行了展望。     

魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究

利用β-甘露聚糖酶产品水解魔芋胶制备魔芋葡甘露低聚糖的工艺条件。在加样顺序、pH、酶添加量、时间、温度等单因素试验的基础上,进一步通过正交试验确定的最佳工艺条件为:魔芋胶浓度10g/L,酶添加量为100U/g,pH5.5,45℃条件下,酶解时间1.5h。再利用酵母发酵去除可发酵性糖的方法,以获得最终产物为100%的魔芋葡甘露低聚糖。     

魔芋葡甘聚糖酶实验性生产条件初探

在5L发酵罐上用正交试验检测不同温度、pH和接种量对魔芋葡甘聚糖酶发酵生产的影响。试验表明,产酶的最佳条件为温度50℃,pH5.5～6.0,接种量10%,发酵前期搅拌速度100r·min-1,通气量20L·h-1,6h后搅拌速度改为50r·min-1,通气量10L·h-1,在此条件下获得的酶比活力为4.812×106U·g-1,总活力达到7.810×106U·L-1。培养8h后细菌生物量、产物含量迅速提高,24h达到顶峰时期。发酵动力学属于偶联型。     

水飞蓟宾葡甲胺的结构与溶解性

本文以紫外分光光度法(UV)、差示扫描量热法(DSC)、液质联用(HPLC-ESI-MS)等方法分析合成的水飞蓟宾葡甲胺的结构,并测定了其在25 ℃水中的溶解度.结果表明,水飞蓟宾葡甲胺以盐的形式存在,有别于水飞蓟宾与葡甲胺的简单混合.水飞蓟宾葡甲胺在酸性流动相溶液中容易解离成水飞蓟宾与葡甲胺,水飞蓟宾的物理化学性质没有改变,因此,HPLC法分析水飞蓟宾葡甲胺有局限性,DSC法分析可以作为水飞蓟宾葡甲胺质量的参考依据.水飞蓟宾的溶解度为37.350 mg/L,水飞蓟宾葡甲胺的溶解度为7182.50 mg/L,水飞蓟宾葡甲胺明显改善了水飞蓟宾在水中的溶解性能.     

葡枝根霉NG0305酶催化甾体C11α-羟基化的研究

应用本实验室保藏的葡枝根霉Rhizopus stolonifer NG0305对甾体化合物烯睾丙内酯(3-oxo-4,6-diene-Pregna-17-aloha-hydroxy-21-carboxylic acid gama-lactone)进行酶催化C11α-羟基化反应的研究。研究结果表明,菌体培养的碳源供应对菌体所产羟化酶的活力有重要影响。采用葡萄糖和淀粉组合碳源,并加入适量的黑曲霉糖化酶的方式,解决了葡萄糖抑制的问题,并缩短了菌体培养反应时间,得到高羟化转化率。酶转化反应88h后,提取吸附在菌丝球内的产物,应用液相色谱测定,结果表明C11α-羟基化转化率达到了53．0％。     

来源嗜碱性芽孢杆菌N-227β-环糊精葡基转移酶基因分析及在大肠杆菌中的诱导表达

很多细菌可以产生环糊精葡基转移酶,对来源于嗜碱性芽孢杆菌N-227菌株染色体上一段编码β-环糊精葡基转移酶基因、包含有自己的启动子且能够直接在大肠杆菌中表达的DNA序列进行测序分析,该片断DNA包含有4114bp,从745位点到2883位点包含2139个碱基,为一个推定的编码713个氨基酸的蛋白质阅读框,和来源于Bacillus circulansA11的β-环糊精葡基转移酶氨基酸完全一致;具有环糊精葡基转移酶典型的五个结构域A-E,在A-B结构域中包含有七个属于α-淀粉酶家族的保守区域(I-VII)。对该酶基因进行PCR并克隆到表达载体pET28b上,利用乳糖进行诱导表达,获得了高效表达,环化活性为11.75mg/min/mL。这对于β-环糊精葡基转移酶的应用和降低成本具有重要的价值。