沙冬青AmFAD7和AmFAD8基因的克隆与转化及其功能初步分析

对强抗逆植物蒙古沙冬青2个脂肪酸去饱和酶基因AmFAD7和AmFAD8的功能进行了初步研究。结果表明:(1)AmFAD7和AmFAD8的编码蛋白分别含455和457个氨基酸残基。(2)半定量RT-PCR分析显示,在野外生长植株的嫩叶中,AmFAD7表达量在夏季很低、冬季较高,春秋两季略低于冬季,而AmFAD8在春秋两季和初冬时表达量高于其他月份;在低温(4℃~-6℃梯度降温)处理2~48h的幼苗中,AmFAD7的表达呈先降低后升高的变化趋势,而AmFAD8的表达比处理前略有上调;在高温(42℃)处理2~48h的幼苗中,2个基因的表达均被抑制,尤其对AmFAD7的抑制较为迅速而且明显;在干燥处理2~48h的幼苗中,AmFAD7的表达量有较明显的升高,而AmFAD8则略有降低。(3)成功构建了2个基因的植物表达载体(p3300-35S-AmFAD7和p3300-35S-AmFAD8)并转化拟南芥,分别获得18和16个转基因株系。RT-PCR检测表明,其中F7-1和F7-2以及F8-1~F8-4转基因株系中目的基因的表达量均较高。(4)相对电导率分析显示,在正常温度下,AmFAD7转基因株系(F7-1和F7-2)的相对电导率与野生型无显著差异;在低温(-1℃)胁迫24h后,F7-1和F7-2的相对电导率(分别为32.8%和36.1%)显著低于野生型(48.5%),而在高温(37℃)胁迫24h后,F7-1和F7-2的相对电导率(分别为44.7%和41.9%)显著高于野生型(33.2%)。研究表明,AmFAD7在转录水平受低温和干燥胁迫的诱导,但被高温胁迫抑制,而AmFAD8的转录受低温诱导但被干燥和高温胁迫抑制;在拟南芥中组成型表达AmFAD7增强了转基因植株在低温胁迫下细胞膜的稳定性及其耐冻性,但却增加了其在高温胁迫下的细胞膜损伤程度和热敏感性。     

蝴蝶兰PhNAC1基因序列分析及对低温胁迫的响应

为探讨NAC转录因子在蝴蝶兰低温胁迫响应中的分子调控机理,该研究以蝴蝶兰的叶片为材料,运用RT-PCR及RACE技术克隆得到一条蝴蝶兰的NAC转录因子基因完整的cDNA序列,命名为PhNAC1(GenBank登录号MF797909),并分析了其在两种低温条件下的表达模式。结果表明:PhNAC1基因cDNA序列全长1 442 bp,ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。预测其蛋白分子量为35.22 kDa,等电点为6.95,属于稳定亲水性蛋白。二级结构预测表明,无规则卷曲和延伸链为该蛋白的主要结构元件,与三级结构预测结果基本相符。PhNAC1编码的氨基酸序列与其他已登录的兰科植物NAC蛋白进行同源序列比对,表明与小兰屿蝴蝶兰(XP_0205763790)亲缘关系较近,序列一致性达97%,其次为铁皮石斛(XP_020695081),一致性为84%。实时荧光定量PCR分析表明,PhNAC1基因在营养器官和生殖器官中均有表达,在蕊柱中的表达量最高。在11℃/6℃低温条件下,PhNAC1基因的转录表达水平在前5天随着处理时间逐渐升高,到第7天开始下降;在4℃低温条件下,PhNAC1基因的表达水平在处理0.5 h时表达量有所下降,1 h后表达量上升至对照水平,之后无明显变化,在处理24至48 h又逐渐升高,推测PhNAC1基因参与蝴蝶兰低温胁迫响应。     

藜麦CqSAP8基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

该研究根据NCBI公布的藜麦胁迫相关蛋白(SAP)基因CqSAP8序列进行克隆,利用生物信息学分析CqSAP8蛋白序列、理化性质和结构特点,并采用qRT PCR方法检测CqSAP8基因表达的组织特异性及在非生物胁迫下的相对表达。结果表明：(1)藜麦CqSAP8基因CDS全长528 bp,编码175个氨基酸;预测CqSAP8蛋白分子量为18.73 kD,理论等电点为7.46,属于稳定的亲水性蛋白质;CqSAP8蛋白在N端和C端分别含有A20和AN1保守域,是SAP蛋白最典型的类型。(2)序列比对与进化分析显示,藜麦CqSAP8与甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8亲缘关系最近,序列相似性分别为89.66%和89.47%。(3)qRT PCR分析表明,藜麦CqSAP8基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达,且在种子中表达量最高;CqSAP8基因在干旱和高温胁迫12 h表达量达到最大值,分别是对照的13.09和17.47倍,高盐和低温胁迫下的最大表达量均为对照的3.91倍,说明藜麦CqSAP8基因响应多种非生物胁迫应答;另外,藜麦CqSAP8的表达量在ABA胁迫下24 h急剧升高,推测CqSAP8基因在非生物胁迫前期的响应不依赖ABA。该研究为进一步研究CqSAP8基因功能及抗逆分子机制奠定了基础。     

拟南芥ABI5亚家族基因表达特性的比较研究

拟南芥ABI5亚家族转录因子AtDPBFs (DC3 promoter binding factors)/ABFs (ABRE binding factors)由9个高度同源的成员组成,它们参与了植物生长发育过程中种子成熟和休眠、开花时间、根的生长、ABA信号转导和逆境响应等过程。该研究采用qRT-PCR方法分析了拟南芥ABI5亚家族9个基因在不同组织和生长阶段、以及苗期对ABA、高盐、高渗和低温等响应下mRNA的相对含量变化,以明确9个基因的生物学功能及其异同。结果显示:(1)在拟南芥种子刚萌发时有6个基因较5 d龄幼苗均极显著大量表达;在营养生长阶段,未检测到At5G42910基因的信号,其余8个基因均随幼苗生长mRNA相对含量也相应增加,且AtDPBF2和AtDPBF4的增加幅度最大;13 d龄幼苗中ABF3的相对含量最高,约为ABI5的59倍。(2)在生殖生长阶段,茎和根中9个基因均少量表达,而在花和种子中均大量表达,且ABI5表达量最高,分别约为根中表达量的122倍和730倍;叶片中ABF2表达量最高,果荚中AtDPBF2表达量最高,两者分别约为根中表达量的10倍和12倍;At5G42910基因在花和果荚中高表达,约为其他器官表达量的5倍。(3)100 mmol·L~(-1) NaCl、50μmol·L~(-1)山梨醇、10μmol·L~(-1)ABA分别处理8 d后,各处理幼苗生长发育较对照明显减缓,且随着处理浓度上升抑制效应进一步加剧。(4)20μmol·L~(-1) ABA处理13 d龄拟南芥幼苗后,ABF1和ABI5基因的mRNA相对含量增加最高,二者的增幅均接近30倍;100 mmol·L~(-1)山梨醇处理使ABF1和ABI5基因的mRNA相对含量增加最高,两者的增幅分别接近120倍和30倍;100 mmol·L~(-1) NaCl处理导致大多数ABI5亚家族基因表达下调,但仅ABF3基因有较明显的上调;4℃低温处理使ABF1和ABI5基因的mRNA相对含量分别上升了约110倍和25倍。研究表明,在营养生长阶段ABI5亚家族8个成员的表达逐渐增加,进入生殖生长阶段后各基因的表达大幅上升且存在组织差异性,花和种子中9个基因均大量表达而根和茎中少量表达,叶片中ABFs基因发挥主要作用,在种子形成及成熟过程中ABI5和AtDPBF2基因发挥主要作用;在非生物胁迫响应方面,ABF1和ABI5主要响应ABA和渗透胁迫,ABF3主要响应盐胁迫,应对冷胁迫时除ABF1外,ABI5也发挥重要作用,推测At5G42910基因在种子形成以及成熟过程中具有重要作用。     

低温胁迫下6种木兰科植物的生理响应及抗寒相关基因差异表达

分析了6种木兰科植物对低温胁迫的生理响应及耐寒相关调控基因HSP90和WRKY33的差异表达,为木兰科植物抗寒机理的研究和抗寒品种的选育提供理论基础。结果表明,6种木兰科植物的低温LT50在-10.64—-22.06℃,从高到低依次为红花深山含笑、峨眉含笑、杂交含笑、阔瓣含笑、六瓣含笑和乐东拟单性木兰;低温过程中,6种木兰科植物叶片可溶性蛋白(SP)、游离脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物歧化酶(POD)活性呈先升高后降低的趋势,可溶性糖(SS)和丙二醛含量(MDA)则不断积累;筛选出REC、MDA、SP、SS和Pro作为6种木兰科植物抗寒性评价的关键指标;聚类分析将6种木兰科植物在抗寒性能上分为强、中、弱三类,分别为乐东拟单性木兰和六瓣含笑,阔瓣含笑、杂交含笑和峨眉含笑,以及红花深山含笑。对HSP90、WRKY33基因的差异表达分析表明,2个基因在6种木兰科植物中的相对表达量呈先升高后降低的趋势,在临近各树种LT 50时,2个基因的表达被强烈抑制且后期表达量不可逆。0℃时,2个基因的表达量差异不显著;-5℃时,2个基因开始被激活,表达量增加;-10℃时,HSP90、WRKY33基因在红花深山含笑叶片中的表达量较-5℃时分别下调了0.76倍和0.68倍,而在其他5个树种中的表达被进一步激活;-15℃时,HSP90和WRKY33基因在抗寒性中等的阔瓣含笑、杂交含笑、峨眉含笑中亦被强烈抑制,较-10℃时分别下调了0.38倍、0.33倍、0.32倍和0.71倍、0.72倍、0.74倍,在抗寒性强的乐东拟单性木兰和六瓣含笑中的表达被进一步激活;-20℃以后,2个基因在6个树种中的表达均被强烈抑制,但在抗寒性最强的乐东拟单性木兰中的表达量仍高于其他5个树种。抗寒基因的激活与表达是影响植物抗寒性的重要因素,抗寒性不同的树种对低温的应答机制明显不同。抗寒性越强的树种越能快速启动低温应答机制,激活抗寒相关基因的表达,进而调整生理生化活动以抵御和适应冷应力。不抗寒树种中抗寒基因的表达则受到抑制,降低了其对低温逆境的耐受能力。     

水曲柳BZR1基因克隆及其表达模式分析

研究水曲柳BZR1基因应答非生物胁迫及激素信号的表达模式,对探究BR在水曲柳生长发育及响应环境胁迫方面的作用有重要意义。本研究以水曲柳为材料,PCR克隆得到目的基因,通过生物信息学软件分析分子结构特征,利用荧光定量PCR探究FmBZR1在低温、盐胁迫及ABA、IAA、GA3诱导下的表达模式。生物信息学分析表明,FmBZR1基因全长984 bp,编码327个氨基酸,FmBZR1蛋白为亲水性蛋白,与樟子松BZR1蛋白的同源性较高。在非生物胁迫与激素诱导下,结果表明,与对照组相比,FmBZR1基因表达量有显著差异。低温处理6 h、盐处理24 h后表达量最高,分别为对照组的1.98、10.13倍。ABA、IAA、GA3处理3 h后基因表达量最低,分别为对照组的0.52、0.41、0.50倍;GA3处理24h后基因表达量最高,为对照组的6.23倍。FmBZR1基因在水曲柳生长发育及各种胁迫应答的过程起到了十分关键的作用。     

小桐子早期光诱导蛋白ELIP基因的克隆及其与靶向miRNA的互作与低温下共表达分析

【目的】作为一种喜温冷敏植物,低温严重影响小桐子的生长发育、地域分布与产量。前期工作发现12 ℃低温锻炼可显著提高小桐子的抗冷性,小桐子早期光诱导蛋白(ELIP)基因是低温高响应基因。为探究JcELIP在小桐子低温响应中的作用,全面了解JcELIP的结构、调控机制、进化关系及JcELIP与miRNAs的互作关系,也为后续小桐子抗冷分子育种提供一个重要的候选基因资源。【方法】通过RT-PCR克隆了小桐子JcELIP基因并对其进行了系统的生物信息学分析,采用RT-qPCR分析了JcELIP基因在根、茎、叶中及12 ℃低温锻炼过程中的表达变化,鉴定了与JcELIP互作的miRNAs,进行了12 ℃低温锻炼过程中的共表达分析。【结果】结果显示,该基因完整的开放阅读框(ORF)为585 bp,编码194个氨基酸,蛋白大小为2.04 kD,理论等电点为9.59,属于稳定的疏水碱性蛋白,具有3个疏水跨膜螺旋;三级结构主要由ɑ-螺旋和无规则卷曲组成,具有叶绿素a/b结合位点。顺式作用元件预测显示JcELIP具有脱落酸等激素响应元件。进化分析显示,小桐子JcELIP与木薯MeELIP同源性最高。RT-qPCR分析显示,正常生长条件下小桐子JcELIP在根、茎、叶中的表达量无显著差异;12℃冷锻炼条件下JcELIP在叶中表达快速上调,48 h时其表达量达到对照组的64.8倍,表明JcELIP参与了小桐子对冷胁迫的响应与适应。基于小桐子降解组数据,鉴定到miR390-x、miR6476-x和novel-m0090-3p等8个miRNAs对JcELIP的表达具有调控作用;共表达分析结果表明在12 ℃低温锻炼过程中JcELIP的表达受miR390-x和novel-m0090-3p显著的负调控。     

低温胁迫下烤烟幼苗叶片光合作用和抗氧化能力基因差异表达谱

对低温(5—7℃)胁迫下烤烟"K326"幼苗叶片光合指标、膜氧化水平及其抗氧化指标进行测定,并利用数字化基因表达谱技术进行基因差异表达分析。低温胁迫后烤烟幼苗叶绿素含量、光合能力显著下降,脯氨酸含量、丙二醛含量上升,超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、抗坏血酸含量和谷胱甘肽含量均显著上升。低温胁迫后有2357个基因发生了显著差异表达,其中1673个基因表达上调、684个基因表达下调,其分子功能、细胞位置和主要代谢过程均涉及光系统、膜氧化系统和抗氧化系统。对涉及到的代谢过程进行分析,结果表明:光合天线蛋白调控基因表达量均显著下降、光合作用的主要调控基因表达量多数表现为显著下调、而与氧化能力相关的谷胱甘肽代谢差异表达基因大多数显著上调。基因差异表达谱分析结果和低温胁迫后叶片光合能力、抗氧化能力生理生态指标测定结果基本一致,为进一步研究低温胁迫对作物的生态影响和研究基因克隆与功能提供基础。     

花生温度诱导载脂蛋白基因AhTIL1的克隆和表达研究

温度诱导的载脂蛋白(temperature induced lipocalins,TILs)与植物在热、冷、光、氧化等胁迫下的稳定性相关,旨在克隆花生中的温度诱导的载脂蛋白基因,分析其在响应低温、高温中的作用。从花生c DNA文库中筛选到一个TIL候选基因,命名为Ah TIL1,通过PCR扩增获得了其基因组和候选启动子的序列,并利用实时定量PCR等方法检测了该基因在花生不同组织、种子不同发育时期和温度胁迫下的相对表达量。序列分析结果表明,该基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为558 bp,编码185个氨基酸。生物信息学分析显示,推测的Ah TIL1蛋白质相对分子质量为21.4 k D,等电点为6.78。序列比对结果显示,该蛋白氨基酸序列同其他物种TIL蛋白显示出很高的同源性。对候选启动子预测结果表明,该基因的候选启动子包含ACE、Box4、G-box、GAG-motif等与光反应相关的调控元件以及与ABA、水杨酸、赤霉素、厌氧等相关的顺式调控元件。基因芯片和RNASeq结果表明,该基因在花生的根、茎、叶、花、果针、种子中均有表达,在花中表达量最高,茎中次之,在根中表达量最低;Ah TIL1在果针入土后表达量下降,随着荚果的膨大和种子的成熟,Ah TIL1的表达量逐渐增加。实时定量PCR结果证明,Ah TIL1在高温和低温诱导3、6、12和24 h后上调表达,在48 h后表达量下降。Ah TIL1可能在花生响应低温、冷胁迫中发挥着重要的作用。     

热应激对虹鳟CRT基因和PDIA4基因mRNA表达的影响

在转录组测序研究中,筛选出了与虹鳟热应激相关的钙网蛋白基因CRT和蛋白二硫键异构酶基因PDIA4。为研究其在热应激过程的表达变化规律及应答机制,本试验以全同胞虹鳟为研究对象,通过持续升温,分别在18℃(对照组)、21℃、23℃、24℃、25℃和26℃下随机挑选3尾虹鳟,采用实时荧光定量(Real-time FQ-PCR)方法测定并分析了肝脏和头肾CRT和PDIA4 mRNA的表达变化特征。结果显示,与18℃相比,肝脏、头肾CRT表达量分别在24℃、26℃时显著上调且达到最高(19.16倍和2.76倍, p0.05);PDIA4 mRNA表达量分别在25℃、26℃显著上调且达到最高(57.45倍和188.68倍, p0.05)。肝脏CRT的表达量在24℃和25℃时显著高于头肾(10.89倍和8.46倍, p0.05),而PDIA4表达量在24℃、25℃和26℃时显著低于头肾(p0.05)。因此认为,热应激诱导虹鳟肝脏、头肾中CRT和PDIA4 mRNA的表达上调,25℃以上时,虹鳟热应激反应强烈,且对基因表达水平的影响存在组织特异性,肝脏对热刺激的反应比头肾更敏感。本研究为阐述鱼类在热应激下适应性保护机制提供指导。     

CXCL1: A new diagnostic biomarker for human tuberculosis discovered using Diversity Outbred mice

More humans have died of tuberculosis (TB) than any other infectious disease and millions still die each year. Experts advocate for blood-based, serum protein biomarkers to help diagnose TB, which afflicts millions of people in high-burden countries. However, the protein biomarker pipeline is small. Here, we used the Diversity Outbred (DO) mouse population to address this gap, identifying five protein biomarker candidates. One protein biomarker, serum CXCL1, met the World Health Organization’s Targeted Product Profile for a triage test to diagnose active TB from latent M.tb infection (LTBI), non-TB lung disease, and normal sera in HIV-negative, adults from South Africa and Vietnam. To find the biomarker candidates, we quantified seven immune cytokines and four inflammatory proteins corresponding to highly expressed genes unique to progressor DO mice. Next, we applied statistical and machine learning methods to the data, i.e., 11 proteins in lungs from 453 infected and 29 non-infected mice. After searching all combinations of five algorithms and 239 protein subsets, validating, and testing the findings on independent data, two combinations accurately diagnosed progressor DO mice: Logistic Regression using MMP8; and Gradient Tree Boosting using a panel of 4: CXCL1, CXCL2, TNF, IL-10. Of those five protein biomarker candidates, two (MMP8 and CXCL1) were crucial for classifying DO mice; were above the limit of detection in most human serum samples; and had not been widely assessed for diagnostic performance in humans before. In patient sera, CXCL1 exceeded the triage diagnostic test criteria (>90% sensitivity; >70% specificity), while MMP8 did not. Using Area Under the Curve analyses, CXCL1 averaged 94.5% sensitivity and 88.8% specificity for active pulmonary TB (ATB) vs LTBI; 90.9% sensitivity and 71.4% specificity for ATB vs non-TB; and 100.0% sensitivity and 98.4% specificity for ATB vs normal sera. Our findings overall show that the DO mouse population can discover diagnostic-quality, serum protein biomarkers of human TB.     

Proteomic analysis of inviable salmonid hybrids between female masu salmon Oncorhynchus masou masou and male rainbow trout Oncorhynchus mykiss during early embryogenesis

Early embryos of inviable hybrids between female masu salmon Oncorhynchus masou masou and male rainbow trout Oncorhynchus mykiss at 9, 12, 15 and 20 days after fertilization were examined for protein expression profiles. A total of 44 proteins, mostly down-regulated products of house-keeping genes and those involved in nucleic acid metabolism or chromatin replication, were identified in hybrid embryos by mass spectrometry analysis and protein database searching. The identified down-regulated proteins may be responsible for the inviability in the hybrids.     

The effect of high water temperatures on the allometric scaling effects of energy and protein starvation losses in juvenile barramundi, Lates calcarifer

This study was undertaken to examine the effects of high water temperatures on the allometric scaling effects of energy and protein starvation losses by juvenile barramundi, Lates calcarifer. The somatic energy and protein loss was examined in fish of varying sizes when starved for 24 or 25 days at temperatures ranging from 23 °C to 38 °C. The amount of energy and protein lost varied according to both size and temperature and was consistent with the function of a*W(b), where a is a temperature dependent coefficient, W the animal's weight and b an exponent relating energy loss to live-weight. The coefficient for energy or protein loss varied and was described by a polynomial function, with a general increase from 23 °C to 32 °C, before a dramatic decline after 35°C. In contrast, the exponent for energy loss was relatively constant between 23 °C and 35 °C, but showed a rapid increase at 38 °C. Both the coefficients and exponents of protein loss mirrored that of energy loss. Analysis of the protein and lipid contributions to energy loss shows that typically lipid loss accounts for the greater part of energy loss (~67%), but also shows that above 35 °C protein energy loss increases (from ~33% to ~39%) while the losses seen from lipid catabolism remain the same. These results show that one of the main nutritional issues associated with heat stress in fish is a dramatic increase in endogenous loss of protein.     

Hemoglobin interactions with αB crystallin: a direct test of sensitivity to protein instability

As a small stress response protein, human αB crystallin, detects protein destabilization that can alter structure and function to cause self assembly of fibrils or aggregates in diseases of aging. The sensitivity of αB crystallin to protein instability was evaluated using wild-type hemoglobin (HbA) and hemoglobin S (HbS), the glutamate-6-valine mutant that forms elongated, filamentous aggregates in sickling red blood cells. The progressive thermal unfolding and aggregation of HbA and HbS in solution at 37°C, 50°C and 55°C was measured as increased light scattering. UV circular dichroism (UVCD) was used to evaluate conformational changes in HbA and HbS with time at the selected temperatures. The changes in interactions between αB crystallin and HbA or HbS with temperature were analyzed using differential centrifugation and SDS PAGE at 37°C, 50°C and 55°C. After only 5 minutes at the selected temperatures, differences in the aggregation or conformation of HbA and HbS were not observed, but αB crystallin bound approximately 6% and 25% more HbS than HbA at 37°C, and 50°C respectively. The results confirmed (a) the remarkable sensitivity of αB crystallin to structural instabilities at the very earliest stages of thermal unfolding and (b) an ability to distinguish the self assembling mutant form of HbS from the wild type HbA in solution.