逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2／0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2／0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2／0细胞腹腔免疫BALB／c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCVE1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合.     

携带猪γ干扰素基因逆转录病毒载体的构建及其在猪肾细胞(PK-15)中的表达

将梅山猪γ干扰素基因定向插入逆转录病毒载体pLXSN(neor),构建逆转录病毒重组质粒,利用脂质体介导法将重组质粒转染逆转录病毒包装细胞系PA317,转染细胞经含G418(400μg/mL)培养基筛选一周后获得稳定产毒的PA317细胞系。从细胞培养上清中提取RNA,进行RT-PCR检测,扩增到目的片段;将上清感染猪肾细胞(PK-15),经含G418(400μg/mL、600μg/mL和800μg/mL)的DMEM筛选一周,间接免疫荧光表明表达的猪γ干扰素主要锚定于细胞膜。收取PK-15细胞上清,在牛肾细胞(MDBK)上进行干扰素抗病毒活性检测,结果显示重组病毒表达的猪γ干扰素抗水泡性口炎病毒(VSV)的活性为1200IU/106cells.48h。以表达的干扰素处理PK-15细胞后,经细胞病变抑制法测定,重组猪γ干扰素可以抵抗口蹄疫病毒(FMDV)感染。试验结果表明猪γ干扰素基因已成功插入逆转录病毒基因组并在PK-15细胞中表达,表达的重组猪γ干扰素具有较强的抗病毒生物活性。     

小鼠T-bet逆转录病毒载体的构建与功能验证

为在小鼠细胞中表达并研究T-bet功能,首先构建了含有报告基因Thy1.1的小鼠T-bet逆转录病毒载体,并将构建的载体质粒转染病毒包装细胞系包装成重组病毒,再利用重组病毒分别感染NIH-3T3和D9细胞系检测其感染能力。之后,使用该重组病毒感染T-bet敲除小鼠的CD4+T淋巴细胞,流式细胞术检测T-bet及其下游靶基因Ifng的表达情况。经验证,重组的逆转录病毒感染T-bet敲除小鼠T淋巴细胞后可以在细胞中表达T-bet,并进一步引起下游靶基因Ifng的表达上调,证明本研究中外源表达的转录因子T-bet具有正常功能。综上所述,本实验成功构建了含有报告基因的小鼠T-bet重组逆转录病毒载体,为进一步在小鼠细胞中研究T-bet功能奠定了基础。     

共表达口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因牛肾细胞株的筛选及稳定性

[目的]筛选稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的牛肾细胞(Madin-Darby bovinekidney,MDBK)株.[方法]采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法从重组质粒pMD-P1-2A和pMD-3C中分别扩增口蹄疫病毒衣壳前体蛋白P1-2A基因和蛋白酶3C基因,将两基因依次插入逆转录病毒载体pBABE-puro.重组逆转录病毒载体pBABE-puro/P1-2A-3C和pVSV-G质粒载体用脂质体介导共转染GP2-293包装细胞.产生的重组逆转录病毒感染MDBK细胞后使用嘌呤霉素筛选抗性细胞.利用克隆环套取法得到单克隆细胞.经间接免疫荧光和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)方法检测MDBK细胞中衣壳蛋白的表达,并在电镜下观察口蹄疫病毒空衣壳.[结果]成功筛选到稳定表达口蹄疫病毒衣壳蛋白的MDBK细胞株,衣壳前体蛋白P1-2A在蛋白酶3C裂解作用下正确组装成空衣壳.[结论]该研究为口蹄疫亚单位疫苗的研制提供了实验材料.     

表达HCV包膜蛋白的两种重组腺相关病毒疫苗的制备及免疫原性分析

重组腺相关病毒载体(rAAV)可在动物体内高水平地持久表达外源基因,本研究采用两种rAAV载体(rAAV1与rAAV2)构建了表达丙型肝炎病毒中国分离株包膜糖蛋白(E1E2)的载体疫苗并以之免疫小鼠,分别采用免疫荧光证实其表达与总抗体,用HCV假病毒系统检测其中和抗体水平,用ELISpot分析其细胞免疫应答,结果表明:rAAV1-E1E2重组载体疫苗单针免疫激发的体液应答明显高于rAAV2-E1E2,rAAV1-E1E2单针注射后3个月可在肌肉组织中检出E2蛋白表达及特异性T细胞应答。上述结果提示HCV重组腺相关病毒载体疫苗单针免疫可引起明显持久的体液与细胞免疫应答。     

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的 构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法 应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果 酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论 本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。     

猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达及其对伪狂犬病病毒的抑制

目的:研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒(PRV)具有抑制作用。方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪Mx1和牛Mx1基因,并克隆到pc DNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转染的方法将其分别导入到PK-15细胞,从mRNA水平和蛋白质水平鉴定重组质粒在细胞内的表达情况,然后用细胞毒性试剂盒检测这两种蛋白是否对PK-15细胞具有毒性。之后,通过荧光定量PCR检测猪Mx1和牛Mx1在攻毒后不同时间、不同攻毒剂量的条件下对PRV的抑制情况,并观察100TCID50病毒攻击细胞72h后的病变程度。结果:成功克隆了猪Mx1和牛Mx1基因,经mRNA水平和蛋白质水平证实,两种重组质粒在PK-15细胞内能够正常表达。从荧光定量PCR和细胞病变的角度来看,细胞内表达的Mx1蛋白对PRV具有显著性的抑制(P0.001)。结论:猪Mx1和牛Mx1基因在PK-15细胞中表达的Mx1蛋白能够抑制PRV在胞内的复制。     

辛德毕斯病毒E2包膜蛋白可溶性表达条件的优化

目的:通过优化表达条件,提高辛德毕斯病毒E2包膜蛋白胞外区的可溶性表达量。方法:构建含E2基因胞外区的重组表达质粒pGEX-6p-1-E2,筛选合适宿主菌和诱导温度,并构建5种分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、 pGro7、pKJE7、 pG-Tf2和pTf16 5种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pGEX-6p-1-E2共表达),筛选最适分子伴侣质粒。结果:(1)E2蛋白的表达量在E.coli BL21、BL21 (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)及Origami B (DE3) 4种表达菌中没有明显差别;(2)16℃诱导时E2蛋白在上清中可溶性表达量最高;(3)分子伴侣质粒pG-Tf2使目的蛋白的可溶性表达量提高了15.7%,作用最为显著。结论:通过优化表达条件及使用分子伴侣共表达系统提高了E2蛋白的可溶性表达,为进一步E2蛋白的相关研究奠定了基础。     

Interaction of CSFV E2 Protein with Swine Host Factors as Detected by Yeast Two-Hybrid System

E2 is one of the envelope glycoproteins of pestiviruses, including classical swine fever virus (CSFV) and bovine viral diarrhea virus (BVDV). E2 is involved in several critical functions, including virus entry into target cells, induction of a protective immune response and virulence in swine. However, there is no information regarding any host binding partners for the E2 proteins. Here, we utilized the yeast two-hybrid system and identified fifty-seven host proteins as positive binding partners which bound E2 from both CSFV and BVDV with the exception of two proteins that were found to be positive for binding only to CSFV E2. Alanine scanning of CSFV E2 demonstrated that the binding sites for these cellular proteins on E2 are likely non-linear binding sites. The possible roles of the identified host proteins are discussed as the results presented here will be important for future studies to elucidate mechanisms of host protein-virus interactions during pestivirus infection. However, due to the limitations of the yeast two hybrid system, the proteins identified is not exhaustive and each interaction identified needs to be confirmed by independent experimental approaches in the context of virus-infected cells before any definitive conclusion can be drawn on relevance for the virus life cycle.     

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2重组体的构建表达与抗原性分析

风疹病毒(Rubella virus, RV)是人类最重要、最常见的致畸病毒之一,但其致畸机理至今尚未完全明了[1].RV的包膜上镶嵌着两个糖蛋白E2和E1,E2/E1以异二聚体的形式在病毒体表面形成刺突结构[2].E2的糖基化程度很高,存在O-联及N-联糖基化位点,糖类在成熟的E2蛋白中所占比重大于三分之一,E2蛋白的糖基化程度影响蛋白功能,糖基化位点的改变可能与RV减毒有关[3].     

融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2的表达及鉴定

目前,传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒（减毒）猪瘟疫苗存在免疫保护期短、毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决上述问题。铁蛋白24个亚基可以自组装成稳定的多聚体纳米颗粒,成为理想的抗原呈递载体和疫苗开发平台。基于此,将铁蛋白与具有较强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2（具有高保守性的保护性抗原）结合,构建融合基因E2-Fe,将该基因克隆到pET28a原核表达载体中,转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞中进行诱导条件的探索及其高效表达,再将表达的融合蛋白进行镍柱纯化、质谱分析、Western-blotting验证及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到pET-28a载体上,0.50%乳糖诱导6 h为融合蛋白E2-Fe表达的最优条件;质谱分析与Western-blotting均显示融合蛋白的大小约为51 kD,与理论值相符;电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm。结果表明,融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2在大肠杆菌中得到高效表达,经镍柱纯化后可获得数量可观的自组装纳米颗粒抗原,为研究新的猪瘟疫苗拓宽了研究思路。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原域的高效表达及间接ELISA方法的初步建立

重组质粒pET-2e转化宿主菌BL21(DE3),以IPTG进行诱导表达,比较不同诱导条件下目的蛋白的表达量,确定其最佳表达条件,使外源基因获得了较高水平的表达,可达茵体蛋白总量的36．6％。Western-blot检测表明表达产物具有良好的免疫反应原性。将收集的纯培养物进行超声波裂解后以镍亲和层析柱纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定了目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度,初步建立了检测CSF血清抗体水平的间接ELISA方法。以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约120头份血清样品进行检测,结果显示：使用囊素与疫苗共同免疫猪的血清抗体水平明显高于未加囊素组猪的血清抗体水平,与以往的报道一致,为以CSFV重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法的标准化奠定基础。     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因DNA疫苗的构建及动物免疫试验

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)主要通过输血传播,可以导致多种临床型的肝炎及其它肝脏疾病,包括肝硬化及肝细胞癌[1,2].目前尚无一种有效的抗HCV的措施,这使人们把眼光放到该病的预防上,DNA疫苗的产生为研制丙型肝炎(丙肝)的预防及治疗性疫苗提供了新的思路.     

丙型肝炎病毒囊膜蛋白基因DNA疫苗的构建及动物免疫试验

丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus,HCV）主要通过输血传播,可以导致多种临床型的肝炎及其它肝脏疾病,包括肝硬化及肝细胞癌。目前尚无一种有效的抗HCV的措施,这使人们把眼光放到该病的预防上,DNA疫苗的产生为研制丙型肝炎（丙肝）的预防及治疗性疫苗提供了新的思路。基因免疫是近几年快速发展起来的一种新型方法,它是将带有目的蛋白的编码基因和表达调控序列的质粒DNA导入机体组织后,使目的基因在体内表达,并全方位的刺激机体的免疫系统,