不同地理种群美洲斑潜蝇及近缘种的rDNA-ITS1序列分析和比较

【目的】通过对美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard 不同地理种群及近缘种间的核糖体DNA第一内转录间隔区（rDNA-ITS1）进行比较,分析美洲斑潜蝇不同地理种群间的遗传分化情况,并为美洲斑潜蝇与近缘种间提供分子鉴别标记。【方法】用PCR产物直接测序法及克隆测序法对我国美洲斑潜蝇8个地理种群的rDNA-ITS1序列进行测序,并调用GenBank中3个近缘种的rDNA-ITS序列,运用软件MEGA3.1对美洲斑潜蝇不同地理种群及近缘种间的rDNA-ITS1序列进行分析。【结果】美洲斑潜蝇8个地理种群间的分化程度较低,只有8个变异位点,遗传距离都在0.02以下,但4个近缘种间的碱基差异显著,遗传距离为0.149～0.390,有126个变异位点,12个美洲斑潜蝇特异性识别位点。【结论】虽然基于rDNA-ITS1序列所显示的美洲斑潜蝇各地理种群之间的遗传分化很小,但是其分化趋势与地理分布基本相吻合;得到的12个特异性识别位点不仅可以作为美洲斑潜蝇与其近缘种间鉴别的分子标记,而且可为今后设计鉴别性PCR引物提供重要的参考依据。     

节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及比对

对8个节瓜（Benincasa hispida var.chieh-qua How）品系基因组DNA中的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列进行扩增,并对品系A39FA的29个克隆产物的核苷酸序列及翻译的氨基酸序列的系统进化和同源性进行了分析,还对29条氨基酸序列进行了比对。扩增结果表明：8个节瓜品系的基因组DNA中均包含长度约260 bp的逆转录酶核苷酸片段;从品系A39FA中获得的29条Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列（CqRt1至CqRt29）的长度为247~267 bp,同源率为46.2%~98.1%,而它们的氨基酸序列同源率为26.7%~98.8%。序列分析结果表明：节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列中碱基A、T、G和C的数量分别为65~96、47~92、45~74和32~49,所有序列均富含碱基A和T,AT/GC比为1.35~2.33;缺失突变是造成节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列长度差异的主要因素,在序列长度和碱基组成方面的明显差异表明节瓜Ty1-copia类逆转座子逆转录酶核苷酸序列具有高度异质性。翻译后的氨基酸序列中有21条序列存在终止密码子突变、12条序列存在移框突变,表明Ty1-copia类逆转座子是节瓜基因组内序列重组的热点。通过聚类分析可将29个逆转录酶核苷酸序列分为5个家族（Family）,分别包括16、4、4、4和1条序列,其中Family 1可能是具有转座活性的逆转座子家族,但存在转录活性的逆转录酶序列仅占全部序列数量的20.69%。将每一家族中的1~2条序列与其他15种植物的Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的氨基酸序列进行比对,显示出较高的同源性。研究结果表明：节瓜与其他植物的Ty1-copia类逆转座子可能有相同起源,而且Ty1-copia类逆转座子可在不同类群间横向传递。     

Q 型烟粉虱扬州种群 cyp6cm1基因内含子抗性相关多态性检测及其5′侧翼序列克隆

【目的】烟粉虱 Bemisia tabaci（Gennadius）已对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类和昆虫生长调节剂等多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性,其中尤以对新烟碱类杀虫剂的抗性问题最为突出。本研究旨在克隆 Q 型烟粉虱扬州种群细胞色素 P450基因 cyp6cm1片段序列及其5′侧翼序列。【方法】分别应用 PCR 和基因组步移技术克隆 cyp6cm1基因片段序列及其5′侧翼序列。【结果】 cyp6cm1基因片段序列包括63 bp 的外显子片段和826~829 bp 的内含子片段。多重序列比对发现,在内含子第195、230和242等3个碱基处存在与新烟碱类杀虫剂抗性相关的单核苷酸多态性（SNPs）。进一步利用基因组步移技术获得了长度为962 bp 的 cyp6cm1基因5′侧翼序列,利用 NNPP 在线分析软件预测转录起始位点为位于起始密码子上游57 bp 处的碱基 A;ConSite 软件分析发现,cyp6cm1基因5′侧翼序列具有 XRE-AhR、CREB、Oct-1和 Broad-complex-4等多种转录因子结合位点。     

二化螟滞育生物钟蛋白TIME-EA4基因的克隆及时空和温度诱导表达分析

【目的】生物测时蛋白TIME-EA4是昆虫特有的一种滞育生物钟蛋白。本文旨在克隆二化螟Chilo suppressalis TIME-EA4基因,研究其在二化螟不同发育时期和不同组织中的时空表达模式及在不同田间种群和不同温度诱导下的滞育和非滞育种群中的表达水平。【方法】通过RACE技术克隆二化螟TIME-EA4基因全长c DNA序列,利用荧光定量PCR的方法检测TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期、6龄幼虫不同组织中的表达模式,及在不同季节采集的田间种群和不同温度处理1h后的滞育和非滞育种群6龄幼虫中的表达量变化。【结果】从二化螟中克隆获得TIME-EA4的c DNA序列(Gen Bank登录号:KU356855),全长821 bp,开放阅读框516 bp,编码172个氨基酸;TIME-EA4基因在二化螟不同发育时期和不同组织中均有表达,且在早期蛹、雌雄成虫以及6龄幼虫的头部、脂肪体和中肠中表达水平较高,同时在滞育幼虫组织中的表达高于非滞育幼虫。此外,TIME-EA4基因在滞育种群中的表达量是非滞育种群的3倍左右,同时在非滞育种群中,该基因的表达明显受10℃及以下低温的诱导,且在10℃时表达量最高,而在滞育种群中该基因的表达受温度影响不明显。【结论】结果说明TIME-EA4基因与二化螟的抗低温胁迫以及低温滞育相关。本研究为TIME-EA4在农业害虫滞育的分子作用机制研究奠定了基础。     

苹果Ty1-copia类逆转座子家族鉴定及特性分析

根据逆转座子RT保守序列设计引物,利用PCR方法从苹果'嘎拉'中克隆了20条RT片段,分析苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子家族特性及进化关系.结果显示,20条逆转录酶保守序列表现出了高度的异质性.结合已报道的37条苹果Ty1-copia类逆转座子RT片段,构建了系统发育树,发现家族1、3和4中具有转座活性的逆转座子的可能性较大;序列分析表明,Ty1-copia类逆转座子是苹果基因组内序列重组的热点.用RT序列为探针进行Southern杂交,发现苹果基因组内Ty1-copia类逆转座子拷贝数高、分布广泛.研究结果为进一步分离具有转座活性的苹果Ty1-copia类逆转座子及其人工诱导芽变奠定了基础.     

Q型烟粉虱扬州种群cyp6cm1基因内含子抗性相关多态性检测及其5′侧翼序列克隆

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)已对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类和昆虫生长调节剂等多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性,其中尤以对新烟碱类杀虫剂的抗性问题最为突出。本研究旨在克隆Q型烟粉虱扬州种群细胞色素P450基因cyp6cm1片段序列及其5′侧翼序列。【方法】分别应用PCR和基因组步移技术克隆cyp6cm1基因片段序列及其5′侧翼序列。【结果】cyp6cm1基因片段序列包括63 bp的外显子片段和826~829 bp的内含子片段。多重序列比对发现,在内含子第195、230和242等3个碱基处存在与新烟碱类杀虫剂抗性相关的单核苷酸多态性(SNPs)。进一步利用基因组步移技术获得了长度为962 bp的cyp6cm1基因5′侧翼序列,利用NNPP在线分析软件预测转录起始位点为位于起始密码子上游57 bp处的碱基A;Con Site软件分析发现,cyp6cm1基因5′侧翼序列具有XRE-Ah R、CREB、Oct-1和Broad-complex-4等多种转录因子结合位点。     

中国甜菜夜蛾地理种群的遗传分化与基因流

【目的】为了明确我国甜菜夜蛾Spodoptera exigua地理种群间的遗传分化及基因流,阐明该种害虫在我国的种群历史动态。【方法】本研究对采自我国20个地理种群的529头甜菜夜蛾样品进行线粒体COI基因序列测定与分析,利用DnaSP 5.0和Arlequin 3.11软件分析种群间遗传多样性、遗传分化、基因流水平及分子变异,构建了单倍型系统发育树与单倍型网络图。【结果】在所分析的所有529个序列样本中,共检测出10个单倍型,其中Hap_1为所有种群所共享。总群体遗传多样性较低（Hd=0.257±0.025,Pi=0.0007±0.0001,Kxy=0.323）,群体间遗传分化较小（F_ST=0.211）,基因流水平较高（N_m=1.870）。AMOVA分析表明,甜菜夜蛾遗传变异主要来自种群内,种群间变异水平较低。各种群间遗传分化程度与地理距离无显著相关性（R²=0.005,P>0.05）。各单倍型相互散布在不同种群中,未形成明显系统地理结构。中性检验（Tajima’s D=-2.177, P<0.05; Fu’s F_S=-8.629, P<0.05)与错配分布分析表明,我国甜菜夜蛾种群曾经历种群近期扩张。【结论】研究结果揭示,甜菜夜蛾各种群间的基因交流并未受到地理距离的影响,验证了甜菜夜蛾具有高度的迁飞能力。     

水稻基因组中一类具有潜在转座活性的Solo—LTR的结构分析和鉴定

在水稻4号染色体两个BAC克隆序列分析中,发现了两个solo-LTR,分别命名为SLTR1和SLTR2。它们分别位于水稻18S rRNA基因和一逆转座子内部。序列比较发现,SLTR1和SLTR2存在着较高的同源性,并与水稻逆转座子RIRE8的LTR序列高度同源,分别为89.1%和70.1%。它们属于一类水稻gypsy类型逆转座子。利用SLTR1和SLTR2与水稻DNA杂交,结果显示两者广泛分布于水稻基因组中,是一类高拷贝重复序列。分别利用SLTR1和SLTR2的两侧特异性序列设计引物进行PCR扩增,结果发现在基因组的相应位置并不存在SLTR1或SLTR2;利用它们两侧被打断基因的特异性片段杂交基因组DNA,得到了同样的结果。这意味着SLTR1和SLTR2来源于基因组的其它位置,并通过某种转座的过程进入18S rRNA基因和另一逆转座子内部。Solo-LTR存在着这种潜在的转座活性,对于进一步研究solo-LTR的来源以及其在基因组进货和基因的表达调控中具有一定的意义。     

自然界斜纹夜蛾核型多角体病毒的基因型多态性

【目的】从基因组序列角度进一步揭示自然界斜纹夜蛾核型多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus, SpltNPV）的基因型多态性。【方法】病毒克隆A5, F1, X3 和 X15分别以活体克隆法分离自SpltNPV埃及株、 日本福冈株和日本小笠原株。根据SpltNPV基因组全序列（GenBank登录号: AF325155）和海灰翅夜蛾核型多角体病毒（S. littoralis NPV, SpliNPV）部分基因序列（GenBank登录号: X99377, X99376 和X98924）设计引物, PCR扩增获得A5, F1, X3 和 X15的多角体蛋白（polyhedrin, polh）基因和ORF18~ORF23序列。【结果】根据多角体蛋白基因序列, X3和X15属于SpltNPV型, 而A5和F1属于SpliNPV型。将A5, F1, X3 和 X15的ORF18~ORF23与SpltNPV和SpliNPV相应的基因序列进行同源性比较。结果发现, F1与SpliNPV以及X3与SpltNPV的核苷酸序列相似性高, 但X3的ORF20在172~558 nt处缺失387 bp。尽管依据多角体蛋白基因序列X15属于SpltNPV型, 但对于ORF18~ORF23序列, X15与SpliNPV的相似性高于与SpltNPV的相似性。同样, A5属于SpliNPV型, ORF18~ORF20与SpliNPV相应的核苷酸序列相似性高, 但ORF21与SpltNPV相应的核苷酸序列一致性为100%, 特别是ORF22, SpltNPV的特有序列出现在A5的基因组中, 而且与SpltNPV的ORF22一致性为100%; 反过来, ORF23又与SpliNPV相应的核苷酸序列相似性高。【结论】所有这些都表明, SpltNPV在自然界不仅存在基因型多态性, 而且即使属于同一基因型, 它们的基因组序列也有显著差异。可利用SpltNPV在自然界的这种异质性筛选适宜防治斜纹夜蛾幼虫的株系。     

基于线粒体COI基因序列的大豆食心虫中国东北地理种群遗传多样性分析

【目的】大豆食心虫Leguminivora glycinivorella (Matsumura)是一种危害大豆的主要害虫,在中国北方地区危害较重。本研究旨在探讨大豆食心虫在中国东北不同地理种群间的遗传变异。【方法】测定了10个不同地理种群153个个体的线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ (mtCOI)基因的657 bp序列,利用DnaSP 5. 0和Arlequin 3. 5. 1. 2等软件对大豆食心虫种群间的遗传多样性、基因流水平和分子变异进行分析。【结果】结果表明：10个地理种群间的COI基因共有36个变异位点和17个单倍型,其中1个单倍型为10个种群所共享。总种群的单倍型多样性指数Hd为0.456,各地理种群单倍型多样度范围在0~0.634之间。总群体的固定系数Fst为0.12545,遗传分化系数Gst为0.06326,总基因流Nm为3.49,且各种群间的基因流均大于1,种群间基因交流的水平较高。【结论】大豆食心虫种群内遗传多样性水平处于中低等水平。总群体和各种群的Tajima’s D检验结果皆不显著,说明中国东北地区大豆食心虫在较近的历史时期内没有出现种群扩张现象。AMOVA分子变异分析结果表明,大豆食心虫的遗传分化主要来自种群内部,而种群间未发生明显的遗传分化。各地理种群的单倍型在系统发育树上和中介网络图上散布在不同的分布群中,缺乏明显的地理分布格局。各种群的遗传距离与地理距离之间没有显著线性相关性,种群间的基因交流并未受到地理距离的影响。     

连续多代UV-B照射对麦长管蚜保护酶活性的影响

【目的】为探明中波紫外线（UV-B）连续多代处理对麦长管蚜 Sitobion avenae (Fabricius ) 的作用机制,发现在UV-B环境压力下害虫进化动力。【方法】用强度为0.25 W/m²的UV-B对每代麦长管蚜进行6 h照射,以处理后成蚜当天产的仔蚜为继代饲养材料,连续饲养18代,提取第1,4,8,12,15和18代的对照组和处理组无翅孤雌成蚜的保护酶液,利用分光光度计测定其超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）3种保护酶活性。【结果】不同世代的对照组间3种保护酶活性均无差异（P>0.05）,处理组间有显著差异（P<0.05）。随着UV-B胁迫世代增加,SOD活性呈先升高后下降的趋势,活性高峰出现在第15 代。POD活性呈下降趋势,处理组活性均高于对照组,且在第1和4代处理组与对照组间差异极显著（P<0.01）。CAT活性先下降后升高,在第8, 12和15代处理组与对照组间无显著差异（P>0.05）,而至第18代处理组与对照组间差异又恢复为极显著（P<0.01）。【结论】麦长管蚜受到短期UV-B胁迫时,其体内SOD,POD和CAT 3种保护酶活性均升高,以抵御UV-B胁迫引起的自由基伤害;而经过到长期UV-B胁迫后,主要依靠SOD和CAT 2种保护酶清除活性氧自由基。     

桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。     

腐食酪螨螨体正己烷提取物的生物活性及成分分析

【目的】确定腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae报警信息素的存在及其成分。【方法】采取正己烷溶剂浸提法提取获得腐食酪螨螨体提取物, 通过观察腐食酪螨对提取物的行为反应确定其生物活性, 最后用气相色谱-质谱联用仪(gas chromatograph-mass spectrum, GC-MS)对提取物的成分进行分析。【结果】腐食酪螨正己烷提取物对该螨有明显的报警作用。GC-MS分析显示, 提取物中含有橙花醇甲酸酯、Z-柠檬醛、E-柠檬醛等成分。【结论】该实验证明了腐食酪螨报警信息素的存在, 为进一步明确各成分及其作用奠定了基础。     

大螟HSC70基因克隆及表达模式分析

【目的】近年来,大螟Sesamia inferens (Walker)对水稻的为害逐渐加重并成为水稻的重要害虫之一。随着全球气候变暖,大螟的分布区域也在逐渐向北延伸。HSP70家族作为分子伴侣参与生物生长发育并对外界刺激产生响应,对生物功能蛋白质的正确折叠及其转运有着重要意义。本研究旨在明确HSP70家族HSC70基因在大螟不同组织、不同发育阶段以及低温胁迫下的表达差异,初步探讨大螟对环境适应的分子机理。【方法】应用RT-PCR及RACE技术从大螟5龄幼虫中克隆得到HSC70基因;进行基因组验证,得到其基因组序列,分析内含子的位置及大小;应用实时定量PCR技术分析大螟HSC70基因的表达模式。【结果】大螟HSC70基因长2 160 bp,命名为Sihsc70（GenBank登录号：KJ639908）,开放阅读框长1 962 bp,编码653个氨基酸,推测分子量为71.6 kDa。其氨基酸序列中含有3个HSP70家族保守序列,在C-末端存在细胞质定位信号,说明大螟HSC70是细胞质热激蛋白家族成员。大螟HSC70基因组序列长度为3 522 bp（GenBank登录号：KJ639909）,含有2个内含子,长度分别为685 bp（位于编码区上游）和803 bp（位于编码区内）。在大螟5龄幼虫的不同组织中Sihsc70表达量差异不显著（P＞0.05）,其中在中肠、后肠和体壁中的表达量较高,在唾腺中的表达量最低;在大螟不同发育阶段中,Sihsc70的表达量在雌成虫最低,较高的3个阶段依次为卵、2龄幼虫和5龄幼虫,分别为雌成虫表达量的6.33,3.21和1.86倍;相对于对照组（27℃）,低温胁迫对大螟5龄幼虫HSC70基因表达的影响差异不显著（P＞0.05）。【结论】结果说明,大螟HSC70基因在不同发育阶段和幼虫不同组织中具有不同的表达水平,而低温胁迫不能诱导该基因大量表达。     

转染从灰飞虱提取的Wolbachia对豆叶螨繁殖适合度和寿命的影响

【目的】Wolbachia是广泛存在于节肢动物体内的一类母系遗传的共生菌, 能够通过多种机制调节节肢动物的生殖。近年来, 为了更进一步地探究Wolbachia与寄主之间的互作机制, 许多研究者展开了Wolbachia的人工转染研究。【方法】我们在实验室条件下将灰飞虱Laodelphax striatellus (Fallén)感染的Wolbachia提取纯化后, 利用显微注射的方法导入豆叶螨Tetranychus phaselus Ehara体内。研究了注入从灰飞虱提取的Wolbachia和豆叶螨自然感染Wolbachia对豆叶螨繁殖适合度和寿命的影响, 并测定了两种Wolbachia的密度随豆叶螨日龄增长的变化情况。【结果】结果显示, 外源Wolbachia在豆叶螨体内的拷贝数极低, 仅为自然感染豆叶螨体内Wolbachia拷贝数的0.5%左右。与自然感染的Wolbachia不同, 外源Wolbachia在豆叶螨种群中不能引起胞质不亲和, 但能够显著降低雌螨的产卵量。【结论】本研究表明, 来自灰飞虱的Wolbachia具有抑制豆叶螨种群扩张的潜在能力, 对豆叶螨生物防治具有一定的应用价值。     

我国三地区黑腹果蝇中Wolbachia的系统发育关系及其对宿主生殖的影响

【目的】Wolbachia 是广泛存在于节肢动物和丝状线虫体内的一类共生菌, 能够以多种方式对宿主产生影响。精卵细胞质不亲和（CI）是其引起的最普遍的表型, 即感染Wolbachia的雄性宿主与未感染或感染不同品系的雌性宿主交配后, 不能产生后代或后代极少, 而感染同品系Wolbachia的雌雄宿主交配后则能正常产生后代。我们前期研究发现, 湖北武汉、 云南六库和天津3个地区黑腹果蝇Drosophila melanogaster被Wolbachia感染。本研究旨在明确这3个地区黑腹果蝇中Wolbachia的系统发育关系及其对宿主生殖的影响。【方法】利用Clustal X软件对Wolbachia的wsp基因序列进行比对, 利用MEGA软件构建系统发育树。采用多位点序列分型（MLST）的方法对Wolbachia进行分型。通过区内交配和区之间杂交的方式研究不同地区黑腹果蝇体内Wolbachia 的关系及其对果蝇生殖的影响。【结果】湖北武汉、 云南六库和天津3个地区黑腹果蝇中感染的Wolbachia都是属于A大组的Mel亚群。这3个地区果蝇感染的Wolbachia的序列类型（ST）不同, Wolbachia之间存在一定的差异。湖北武汉和天津果蝇中的Wolbachia能引起强烈的CI表型, 而云南六库果蝇中的Wolbachia引起的CI强度相对较弱。武汉果蝇中Wolbachia不能完全挽救天津果蝇中Wolbachia引起的CI表型, 而天津果蝇中Wolbachia也不能完全挽救武汉果蝇中Wolbachia引起的CI表型。【结论】武汉和天津地区黑腹果蝇中的Wolbachia可能距离较远。Wolbachia的长期共生可能对黑腹果蝇的进化产生了一定的影响, 湖北武汉与云南六库的黑腹果蝇中感染的Wolbachia属于不同的序列类型, 这2个地区的黑腹果蝇已发生了一定的分歧, 产生了一定的生殖隔离。     

氧化损伤是热胁迫下小金蝠蛾幼虫不能存活的重要原因

【目的】小金蝠蛾Thitarodes xiaojinensis是冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis的寄主昆虫,生活于高海拔、高寒地区,低温适应性强,但在室温下（25~27℃）不能正常存活。本研究检测了热胁迫（27℃）对小金蝠蛾幼虫消化酶及抗氧化系统的影响,以期揭示小金蝠蛾室温不耐受的生理机制。【方法】小金蝠蛾8龄幼虫分两组进行处理：高温组于27℃下饲养,对照组于16℃下饲养。处理24 h后观察虫体状态,并解剖,取中肠及血淋巴。透射电镜观察中肠细胞线粒体结构,分别测定中肠总蛋白酶和糖基水解酶活性,血淋巴丙二醛（MDA）含量,以及血淋巴保护酶系中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的活性。【结果】两组幼虫中肠总蛋白酶及糖基水解酶活性均随反应温度（16~37℃）升高而增强。协方差分析显示,高温组幼虫酶活性极显著低于对照组（P<0.01）。然而,高温组幼虫在27℃下的酶活性与对照组幼虫在16℃下的酶活性无显著差异（P<0.05）。热胁迫下虫体血淋巴中丙二醛含量显著升高（P<0.05）,提示出现了氧化损伤。透射电镜结果显示,高温组中肠细胞线粒体肿胀,膜受损,嵴排列混乱,结构破坏。对活性氧起清除作用的3种保护酶中,仅POD活性显著升高（P<0.05）,SOD和CAT活性均无显著变化（P>0.05）。【结论】消化酶活性的变化可能不是小金蝠蛾室温不耐受的重要因素;氧化损伤是其热胁迫下不能正常存活的一个重要原因。     

海南地区螺旋粉虱三类次级内共生菌的检测

螺旋粉虱Aleurodicus dispersus Russell是一种重要的农林害虫。本研究分别利用次级内共生菌Cardinium和Arsenophonus的16S rDNA和Wolbachia wsp基因对海南省16地区的螺旋粉虱的3种次级内共生菌Cardinium, Arsenophonus和Wolbachia感染情况及相关基因序列进行了测定和分析。3种次级内共生菌Cardinium, Arsenophonus和Wolbachia检测结果表明, Cardinium和Arsenophonus均可感染海南地区的螺旋粉虱, 其中乐东、 陵水和澄迈3个地区所有寄主上的螺旋粉虱的Arsenophonus感染率为100%, 三亚、 琼中和临高部分寄主上的螺旋粉虱的Arsenophonus感染率为66.7%, 而儋州、 五指山和万宁3个地区的螺旋粉虱未发现被Arsenophonus感染; 三亚的番石榴上的螺旋粉虱的Cardinium感染率为100%, 琼海白沙的印度紫檀上螺旋粉虱的Cardinium感染率为100%, 其他寄主上的感染率均小于66.7%; 在所检测的43个螺旋粉虱种群中, 40和31个种群中分别检测出有Arsenophonus 和Cardinium感染, 种群感染率分别为93.0%和72.1%; 在所有检测的个体中, 120个个体中有105个感染Arsenophonus, 93个个体中有70个感染Cardinium, 个体感染率分别为87.5% 和75.3%; 在检测的所有样本中, 只有三亚印度紫檀上的螺旋粉虱检测到Wolbachia, 种群感染率为2.3%, 个体感染率仅为0.8%。这些检测结果表明, 海南地区螺旋粉虱次级内共生菌Arsenophonus的感染率高于Cardinium的感染率, Wolbachia的感染率极低。序列分析表明, 海南不同螺旋粉虱种群的Cardinium的16S rDNA序列一致, 而且与烟粉虱的Cardinium 16S rDNA序列一致性很高, 为97.6%; 不同螺旋粉虱种群的Arsenophonus的16S rDNA序列也完全一致, 其与西班牙加那利群岛螺旋粉虱的Arsenophonus的16S rDNA序列一致性较高, 为85.1%。此外, Wolbachia wsp基因序列分析表明, 海南螺旋粉虱的Wolbachia为B组, 这是国内螺旋粉虱感染Wolbachia的首次报道。     

褐飞虱细胞色素P450基因CYP4C62的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框（不含信号肽编码序列部分）,在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白。将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体。采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD。间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000。Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础。     

亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

【目的】昆虫体内酚氧化酶原（PPO）是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶（PO）抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子（Mg²⁺,Cu²⁺和Fe²⁺）对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的V_max为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L。Fe²⁺存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%（P<0.05）;有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu²⁺存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。【结论】结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。