菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因在棉花中的过量表达和抗冻耐逆性分析

分离出菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因(SoBADH)构建成由CaMV35S驱动的双元植物表达载体pBSB, 农杆菌菌株LBA4404携带该载体转化棉花, 获得转基因棉花植株。65株转基因植株经过PCR筛选、Southern blotting分析证明有45株为成功的转化株, 外源基因已经被整合到棉花的染色体组中, 并以单拷贝插入居多。对部分株系的SoBADH基因的表达进行分析表明均有较高的mRNA和蛋白的表达。经测定这些株系中的甜菜碱脱氢酶活性显著提高, 达到0.66~1.70 nmol/min/mg水平。同时这些转基因株系在盐胁迫下比对照长势强, 株高和地上部分的鲜重显著高于非转基因对照; 在低温胁迫下, 这些转基因株系表现出显著的抗冻性能。结果表明菠菜甜菜碱醛脱氢酶能够在异源植物棉花中过量表达, 并具有较高的酶活性, 转基因棉花可作为抗逆育种的种质材料。     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

茎尖法转基因棉花植株真实性鉴定方法探究

棉花茎尖转化法具备不受基因型限制、转化周期短的优点,是理想的棉花转化体系,但据报道其所获得的转基因植株普遍存在遗传不稳定、高代植株基因丢失的现象。以陆地棉TM?1品种为受体材料,利用茎尖转化法将DsRed2载体转入棉花,经卡那霉素筛选获得16株抗性植株,进一步PCR扩增靶基因,获得6株DsRed2基因片段PCR检测为阳性的植株,初步判断该6株为茎尖转化法获得的转基因植株,但经紫外照射,6个转基因植株均未检测到红色荧光。对其进行靶基因RT?PCR,发现DsRed2基因在6个转基因植株中仅有极低量的表达或无表达。进一步对DsRed2载体的非T?DNA片段,即载体骨架部分进行PCR以及植株内生菌培养检测,结果表明,6个转基因植株均含有完整的DsRed2载体,植株可培养出含有完整载体的内生菌,且内生菌经农杆菌16S核糖体RNA（16S rRNA）片段PCR检测结果为阳性,推测由于茎尖侵染形成农杆菌与植株共生关系,造成假阳性株的现象,进而导致高代转基因植株基因丢失、遗传不稳定的现象。旨在建立一套完整的茎尖法转基因棉花植株真实性的鉴定方法,为进一步深入研究提供参考依据。     

过表达或沉默棉花GhPCBER基因株系的获得及其茎叶木质素和木脂素含量研究

编码苯基香豆满苄基醚还原酶(phenylcoumaran benzylic ether reductase,PCBER)的基因PCBER属于PIP亚家族,是苯丙烷代谢途径中参与木脂素合成的关键基因。该研究构建了棉花GhPCBER基因的植物过表达载体并转化拟南芥,同时构建了VIGS(virus induced gene silencing,病毒诱导的基因沉默)载体转化棉花,采用实时荧光定量PCR技术对GhPCBER基因在不同组织中的表达进行分析;对野生型和转基因植株茎叶组织中的木质素和木脂素含量进行测定分析。结果表明:(1)成功构建了GhPCBER植物过表达载体pGWB17-GhPCBRE以及基因沉默重组载体pTRV2-GhPCBER;经遗传转化获得6株转棉花GhPCBER基因抗性拟南芥植株,同时获得15株GhPCBER基因沉默棉花植株(5株为一组)。(2)PCR检测表明,6株转基因拟南芥均为过表达株系,其中株系1、2、3相对表达量更高,且在茎、叶组织中的表达量分别较野生型提高了7～14倍和6～16倍,表明GhPCBER基因成功在拟南芥中过表达;GhPCBER基因沉默棉花植株的茎、叶组织中的表达量分别比野生型棉株约下降12%和26%,表明烟草脆裂病毒(TRV)体系(pTRV2-GhPCBER)成功抑制了GhPCBER基因的表达。(3)转GhPCBER基因拟南芥茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均显著降低;GhPCBER基因沉默棉花植株茎、叶中木质素和木脂素含量较野生型均极显著降低;组织化学染色观察发现GhPCBER基因沉默棉花植株茎秆颜色明显比野生型染色浅,也证明沉默基因棉花植株茎秆中的木质素含量减少。(4)苯丙烷代谢通路中8个相关基因的实时荧光定量PCR分析发现,过表达或抑制GhPCBRE基因均会导致苯丙烷代谢途径发生重新定向。     

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.     

转萝卜过氧化物酶RsPrx1基因保护拟南芥氧化损伤

为了研究萝卜过氧化物酶RsPrx1的功能,本实验构建了RsPrx1的cDNA克隆和表达载体pBI121-RsPrx1.通过农杆菌用浸花法转染拟南芥,获得转基因植株.对转基因植株的研究表明, 萝卜过氧化物酶RsPrx1可以抑制植物根和株高的生长,但不影响植物的成熟.当植物受到氧化应激时,RsPrx1可以保护植物免受氧化损伤. 因此,萝卜过氧化物酶RsPrx1参与植物的生长发育但不起主要作用,并具有抗氧化作用.     

根癌农杆菌介导AtNHX1基因转化番茄的研究

构建AtNHX1基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将其转入番茄。探讨了外植体类型、农杆菌菌株和不同筛选标记对芽诱导分化的影响。对抗性植株进行PCR检测,获得15株转基因植株。对转基因番茄T1代进行80mmol/LNaHCO胁迫处理,转基因植株的相对生长量高于对照植株,显示AtNHX1基因的导入提高了番茄对碱性盐的耐受性。     

利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗

利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T₁代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T₁代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。     

ptc-miR801人工microRNA表达载体构建及功能初步研究

在构建盐胁迫下青杨microRNA文库中发现了ptc-miR801,为探索植物在盐胁迫条件下ptc-miR801参与胁迫应答的机制,本实验构建了植物表达载体pCAM2300-ami801,经根癌农杆菌EHA105介导、花序侵染法获得拟南芥转基因植株。RT-PCR半定量结果显示ptc-miR801可以在转基因拟南芥中超表达且NaCl胁迫下ptc-miRNA801转基因植株种子萌发率和根长显著高于野生型,说明ptc-miR801超表达增强了转基因拟南芥耐盐性。该试验为进一步研究miR801在杨树胁迫应答机制中的作用奠定基础。     

转油菜素内酯合成基因DET2烟草对NaCI胁迫的反应

通过农杆菌介导法,将含有油菜素内酯合成基因DET2的植物表达栽体pCAMBIA2301-DET2转入烟草,获得转基因烟草植株.用T1代转基因阳性株进行耐NaCl试验,结果显示,NaCl胁迫下转基因烟草、非转基因对照烟草的出苗率、幼苗鲜重、株高及根长均随NaCl浓度增加而下降.但在相同NaCl浓度下,转基因植株鲜重、株高及根长均明显高于非转基因对照烟草,并且转基因植株的丙二醛( MDA)含量低于非转基因植株,诱导蛋白基因P5CS表达高峰出现时间晚于非转基因植株.说明DET2的表达提高了烟草的耐NaCl能力.     

Construction of a phosphate transporter gene expression vector and its usage for tobacco transformation

A plant expression vector was constructed by inserting the phosphate transporter gene, LePT1, which was cloned from the tomato genome, into pCAMBIA2300. An agrobacterium-mediated system was used to transform tobacco and acquire transgenic plants. Analyses of the transgenic plants by PCR and RT-PCR indicated that the exogenous gene was integrated into and expressed by transgenic plants. The growth characteristics of T1 generation transgenic plants were examined, and the phosphate content of transgenic plants in a low-phosphate environment was found to be significantly higher than in wild-type plants.     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

盐爪爪Na^＋/H^＋逆向转运蛋白和焦磷酸酶的亚细胞定位

将盐爪爪Na+/H+逆向转运蛋白基因(KfNHX1)和焦磷酸酶基因(KfVP1)分别构建至植物表达载体,利用基因枪介导的方法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察研究其亚细胞定位.结果表明,转化了KfNHX1(或KfVP1)-GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞仅膜系统散发荧光,而对照组即未转入KfNHX1(或KfVP1)基因的细胞则整体均匀发出荧光.说明KfNHX1和KfVP1可能定位于细胞的膜系统,作为跨膜转运蛋白在离子的调控运输中发挥重要作用.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。     

灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）过表达提高拟南芥的耐盐性。

克隆获得包含完整开放阅读框（0RF）的灰绿藜液泡膜焦磷酸酶基因（CgVP1）cDNA序列,构建成基因表达载体pCAMBIA1301．1-CgVPl后,利用根癌农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,再以抗性筛选方法获得了T3代纯合的转基因植株,经检测外源目的基因已经整合到拟南芥基因组中并能正常表达。分析结果表明,在拟南芥中过表达劬VP1基因后提高了植株抗盐胁迫的能力。     

过量表达大叶补血草LgNHX1基因对拟南芥耐盐性的影响

利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌GV3101将LgNHX1(全长1 656 bp)基因在拟南芥中过量表达.在含30 mg/L潮霉素的培养基上筛选获得LgNHX1的纯合转化子,并对其进行了分子鉴定和耐盐性分析.结果显示,经PCR和RT-PCR鉴定,野生型植株(对照)没有出现扩增条带,而转基因株系有相应的扩增条带,表明LgNHX1的确已经整合到拟南芥的基因组中,并已正常转录.在不同盐浓度处理下,转基因株系生长情况好于野生型对照;转基因植株地上部分和根的干重、鲜重相对高于野生型对照,但差异没有达到显著水平;当盐浓度达到150-200 mmol/L时,两个特基因株系的Na+含量显著高于野生型,K+含量极显著高于野生型.以上结果表明,过量表达LgNHX1基因可能增强了拟南芥将Na+区隔化至液泡的能力,提高了转基因拟南芥的耐盐能力.     

植物多基因干扰载体体系构建与效用分析

多数重要的功能基因属于多基因家族,这些家族成员间存在功能冗余,高效的多基因干扰体系对研究多基因家族成员的生物学功能及其分子调控机制具有重要意义。对pCAMBIA1301载体改造,构建了适用于植物的多基因干扰体系pCAMBIA1301m和pCAMBIA1301s。使用该多基因干扰体系构建了四基因的干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4,4个目标基因为来源于番茄PP2C家族A组的PP2C1、PP2C2、PP2C3和PP2C4,并通过遗传转化导入番茄,用GUS染色和PCR检测转基因阳性植株,再利用RT-qPCR技术检测T₁和T₂代转基因植株中目标基因的干扰效率,用T₂代种子分析转基因番茄对ABA敏感性。结果表明,应用该干扰体系成功获得了四基因干扰的转基因植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。在转基因番茄中4个目标基因的表达量显著低于野生型,其干扰效率均高于70%,转基因番茄种子萌发具有强烈的ABA不敏感性。多基因干扰体系能高效地同时沉默多个目标基因。     

番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究

克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA 1300上hpt II基因,构建中间表达载体p1300~-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA 2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG.酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA 105.通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织.     

转基因迷你番茄及其对酒精引起的胃伤害的保护作用

表皮生长因子(EGF)具有促进多种细胞增殖的作用, 尤其在维持消化道黏膜完整和促进消化道溃疡愈合方面作用巨大。以前的研究多集中在细菌和酵母中表达, 本研究试图以番茄作为生物反应器生产重组人 EGF, 使之成本降低, 应用方便。依据人 EGF 的基因序列, 设计合成了番茄密码子偏爱的人 EGF 基因, 并将其构建到植物表达载体 pCAMBIA2300 中, 通过农杆菌介导得到了含有人 EGF 基因的转基因番茄。放射免疫法检测到每克鲜重果实中的表达量达 3.48 ± 1.01 ng。将果汁灌喂小白鼠 15 天(相当于每鼠每天喂服 24 ng rhEGF)能显著抵抗酒精引起的胃溃疡形成, 溃疡指数由 42.20 ± 18.13 下降为 16.25 ± 9.57。     

Gossypium arboreum GHSP26 enhances drought tolerance in Gossypium hirsutum

Heat‐shock proteins (HSP) are molecular chaperones for protein molecules. These proteins play an important role in protein–protein interactions such as, folding and assisting in the establishment of proper protein conformation and prevention of unwanted protein aggregation. A small HSP gene GHSP26 present in Gossypium arboreum responds to dehydration. In the present study, an attempt was made to overcome the problem of drought stress in cotton. A cDNA of GHSP26 was isolated from G. arboreum, cloned in plant expression vector, pCAMBIA‐1301 driven by the cauliflower mosaic virus 35S promoter and introduced into Gossypium hirsutum. The integration and expression studies of putative transgenic plants were performed through GUS assay; PCR from genomic DNA, and quantitative real‐time PCR analysis. Transgenic cotton plants showed an enhanced drought tolerance, suggesting that GHSP26 may play a role in plant responsiveness to drought. © 2009 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 2010