硫酸铵三步盐析对藻胆蛋白纯化的影响

主要研究了多次硫酸铵盐析对条斑紫菜藻胆蛋白提取纯化效果。对分离提取的对条斑紫菜藻胆蛋白溶液进行了3次硫酸氨溶液盐析,实验结果表明:55%饱和度可以将绝大部分藻胆蛋白盐析;采用不同组合(15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%7个饱和度分别与50%、55%、60%3个饱和度两两组合)二步硫酸铵盐析沉淀藻胆蛋白,使R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白的盐析后纯度(A564/A280)分别达到了1.0和0.45以上,得率分别为1.4%和0.95%;第3次硫酸铵盐析使R-藻红蛋白、C-藻蓝蛋白的纯度分别达到了1.4和0.4以上,最终产率分别为1.3%和0.8%,而变藻蓝蛋白产率有所下降(从0.65%到0.49%),但纯度变化不大。实验证明了采用多次盐析方法可以很大程度提高藻胆蛋白纯度。     

坛紫菜藻红蛋白的规模化制备

为了优化坛紫菜粗提工艺以减轻纯化的压力,研究了我国主要经济红藻之一坛紫菜藻红蛋白大规模制备方法。实验采用“溶胀+组织捣碎”法破碎坛紫菜叶状体细胞,对比了多次硫酸铵梯度盐析对破碎液中藻红蛋白的影响,并进一步用羟基磷灰石层析制备藻红蛋白,最后对所得蛋白做了光谱和电泳鉴定。结果表明,经过4次盐析,藻红蛋白吸收光谱纯度达到0.9 (A564/A280),每次的最佳盐析浓度分别为15％、50％、10％和40％;7 kg阴干紫菜经过4次盐析和1次羟基磷灰石层析后可获得507.82 mg藻红蛋白 (A564/A280＞     

条斑紫菜藻胆蛋白提纯方法优化探索

采用溶胀法与组织捣碎法相结合的紫菜叶状体细胞破碎方法.研究了不同物液比、缓冲液浸泡时间和硫酸氨盐析次数对藻胆蛋白纯度和产率的影响,对比了各种羟基磷灰石的层析效果,并对所得藻红蛋白和藻蓝蛋白做了吸收光谱、荧光发射光谱和SDS-PAGE鉴定.结果表明,在物液比为1:5,浸泡时间为36h时,紫菜综合破碎效果最佳;经过4次硫酸氨盐析后,藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到1.71和0.98,采用Siegelman的方法制备的羟基磷灰石一次层析所得藻红蛋白和藻蓝蛋白的纯度最高,分别达到4.73和4.42,产率分别为0.144%和0.042%,且光谱和电泳鉴定结果均达到商品化要求.     

两种藻胆蛋白对人喉癌Hep-2细胞的光动力杀伤效果

从条斑紫菜中提取高纯度R-藻红蛋白(R-PE)和R-藻蓝蛋白(c-pc),采用MTT法测定主要研究了不同浓度(10、25、50和100μg/ml)R-PE和C-PC分别介导的光动力效应对人喉癌Hep-2细胞的生存率的影响.实验结果显示,两种藻胆蛋白的光动力作用对Hep-2细胞具有杀伤作用.在浓度为100μg/ml,照射剂量为5OJ/cm2的条件下,藻蓝蛋白对应的细胞存活率为64%.藻红蛋白对应的仅为57%;单用碘钨灯处理,Hep-2细胞的存活率达到86.9%;而单独使用这两种藻胆蛋白处理Hep-2细胞,培养24h后,低浓度藻胆蛋白(10、25μg/ml)对细胞的抑制效果不明显,高浓度对细胞生长具有一定的抑制效果,抑制率为68%.实验证明条斑紫菜R-藻红蛋白和C-藻蓝蛋白具有可开发人喉癌治疗光敏剂应用前景.     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白逐级放大的纯化工艺

采用“破碎-盐析-层析”的方法纯化条斑紫菜藻胆蛋白,并在提取规模上逐步放大。首先在综合比较凝胶层析去盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的去盐填料,其次将提取流程的初试原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g和400g三个量,结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻胆蛋白中吸收光谱纯度>3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜的藻红蛋白产率为0.323％,藻蓝蛋白产率为0.148％。由此认为该实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻胆蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。     

三种微藻细胞破碎方法的比较

目的:获得最佳的微藻藻胆蛋白提取方法.方法:采用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙溶液提取法和玻璃珠处理法等四种方法分别对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻三种藻细胞进行破碎,通过测定藻红蛋白的纯度和浓度对四种细胞破碎方法效果进行比较.结果:当细胞密度为1.00g/L时,采用反复冻融法处理紫球藻和蔷薇藻时能够获得最高的藻红蛋白纯度(OD545/OD280),分别为1.250和1.669,藻红蛋白的浓度分别为29.788,mg/L和36.026mg/L,细胞密度对藻红蛋白纯度影响较小;低浓度氯化钙溶液提取法能使念珠藻藻红蛋白的纯度(OD545/OD280)达到0.477.结论:紫球藻和蔷薇藻经反复冻融法破碎细胞,藻红蛋白纯度高,提取效果好;而对念珠藻藻红蛋白提纯采用低浓度氯化钙溶液提取法效果好.     

发菜藻蓝蛋白分离纯化的研究

以发菜为材料,比较了提取液类型和饱和硫酸铵浓度对藻蓝蛋白提取的影响,并对藻蓝蛋白的提取程序和部分特性进行了研究。结果表明:50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)是合适的提取液,体积分数为40%~50%饱和硫酸铵盐析效果优于其它浓度。经过DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析和SuperdexTM200凝胶过滤层析后,藻蓝蛋白纯度达6.2,最大吸收峰位于615 nm,荧光发射峰位于649 nm,由α和β2个亚基组成,其分子质量分别为18 051.17和19 142.27 Da。因此,发菜藻蓝蛋白分离纯化较为理想的程序为:藻粉→50 mmol/L KP缓冲液(pH值7.2)浸泡→French pressure(1 500 kg/cm2)破碎细胞→40%~50%饱和硫酸铵盐析→DEAE-Toyopeal 650 S离子交换层析→SuperdexTM200凝胶过滤层析→较纯的藻蓝蛋白。     

紫球藻藻红蛋白的分离纯化及光谱学特性

采用4℃反复浸提、离心、硫酸铵沉淀、DEAE—Sepharose Fast Flow离子交换柱层析,从紫球藻（Porphyridium cruentum Naegeli）冻干粉中分离纯化藻红蛋白,分离纯度达到4．85,总收率51．9％;经羟基磷灰石柱层析纯化,藻红蛋白纯度达到5．10,总收率34．0％,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示1条带。所分离纯化的藻红蛋白含有3个亚基（α、β、γ）,在可见光区545nm和560nm处有2个吸收峰,在498nm处有1个吸收肩峰。实验结果说明所分离纯化的藻红蛋白纯度符合要求。     

两种藻胆蛋白对人肝癌SMMC-7721细胞的光动力体外杀伤效应

用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定提取自条斑紫菜的R-藻红蛋白(R-PE)和C-藻蓝蛋白(C-PC)经激光介导对人肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率,并检测细胞凋亡率。结果显示在120mg/L浓度下,R-PE在氩离子激光器100J/cm2辐照下对应的细胞存活率为27%,C-PC在He-Ne激光器35J/cm2辐照下对应的细胞存活率为47%;单用2种激光器辐照对应的细胞存活率分别为65%和70%;单用2种蛋白处理细胞在72h后出现对细胞生长的显著抑制,最大抑制率分别为31%(R-PE,120mg/L)和27%(C-PC,250mg/L)。120mg/L的2种藻胆蛋白在对应激光辐照下,于照后8h达到细胞凋亡率最大值,分别为31.54%(R-PE)和32.54%(C-PC)。本实验证明条斑紫菜R-PE和C-PC具有可开发成为光敏剂的应用前景。     

一步柱层析纯化螺旋藻藻蓝蛋白

采用硫酸铵盐析结合疏水层析技术分离纯化螺旋藻中的藻蓝蛋白.试验结果表明,在磷酸盐缓冲体系下藻蓝蛋白粗提液经1.25 mol/L硫酸铵盐析处理后离心脱气,只需采用一步Macro-Prep Methyl 疏水层析,藻蓝蛋白的纯度（A620/A280）可提高到4.017,回收率为19.38%.特征吸收峰和荧光光谱证实纯化后的产物符合藻蓝蛋白的性质,Native-PAGE电泳只出现单一染色带,表明纯化得到的藻蓝蛋白是均一的;SDS-PAGE电泳出现分子量为15.4 kDa、17.3 kDa的2条染色带,分别为藻蓝蛋白的α亚基与β亚基.     

条斑紫菜藻红、藻蓝蛋白α和β亚基基因序列测定及分析

为了获得江苏吕泗的条斑紫菜藻红蛋白α(Pea)和β(Peb)亚基、藻 蓝蛋白α(Pca)和β(Pcb)亚基基因的DNA序列,本文对其基因进行了克隆、 序列测定及分析.根据已发表的基因序列(DQ666487.1)设计引物,对提取自 条斑紫菜叶状体的DNA进行PCR和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白 序列1 357 bp (HM008263.1)和藻蓝蛋白序列1 335 bp (HM008262.1).上述 两段序列与已报道的条斑紫菜相关序列(DQ666487.1)同源性均为99％,与 其它几种紫菜相关序列同源性为88％～98％.两段序列均采用多顺反子转录 策略,排布顺序为5′Untranslated Regions(UTR)- Peb -间隔区- Pea -3 ′UTR 和 5′UTR- Pcb -间隔区- Pca -3′UTR.文中对基因翻译所得氨基 酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测.基于对序列开放阅读框 、启动子、Shine-Dalgarno (SD)序列的分析,本文对条斑紫菜分类地位进 行了讨论.     

条斑紫菜中一种琼胶多糖的分离纯化及鉴定

条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）的热水提取物,经ＤＥ－２３和Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２００柱层析纯化,得到一种含微量硫酸基的琼胶精品（ＰＹ１）。此多糖经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ柱层析鉴定为单一组分,分子量为２２０ｋＤ。紫外光谱显示它不含蛋白质、多肽及核酸。红外光谱揭示它含３,６－内醚－半乳糖的特征吸收以及微量的硫酸基。该多糖的水解产物经气相色谱分析,主要由半乳糖及其衍生物组成,有少量     

Rapid extraction of high-quality genomic DNA from Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta)

We developed a simple, rapid and stable method for extraction of high molecular weight DNA from the marine red alga Porphyra yezoensis Ueda using both guanidium treatment and QIAGEN? kit (Funakoshi, Tokyo, Japan). The method does not require expensive equipment and complex steps. The DNA yield averaged 1.5 μg 100 mg^?1 of Porphyra tissue and the A260/A280 and A230/A260 ratios of the DNA were approximately 1.8 and 0.4, respectively. It was of sufficient quality to be used for not only polymerase chain reactions but also other DNA manipulation techniques such as restriction digestion and construction of genomic libraries.     

一种紫菜多糖的制备及对淋巴细胞生长的影响

用DEAE－纤维素和SephadexG-200柱层析法分离纯化条斑紫菜的热水提取物,从中得到多糖PY2,并测出其分子量为2．0％10^4。用紫外和红外光谱对PY2的性质进行了鉴定。进一步测定了PY2对体外培养的小鼠骨髓细胞及淋巴细胞生长的影响。结果表明,PY2是一种少见的紫菜多糖,它不含有大多数紫菜侈糖具有的3,6－内醚－兰乳糖和硫酸基,它对小鼠脾脏淋巴细胞、胸腺淋巴细胞以及混合淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用,而对骨髓细胞的增殖没有明显的影响。     

条斑紫菜SAMS基因克隆与生物信息学分析

干旱、高盐和低温是限制植物生长和农作物产量的主要逆境因子。S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase,SAMS）与植物抗逆境密切相关,而且超表达SAMS的转基因植物具有更高的抗干旱、高盐和低温能力。进行条斑紫菜（Porphyra yezoensis）S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因（PySAMS）cDNA的克隆及序列特征分析。首先利用电子克隆技术得到基因相关的contig,预测全长并设计引物,最后利用RT-PCR技术成功克隆了PySAMS的cDNA序列（GenBank accession：FJ404748）。该cDNA序列含有长1155nt的完整ORF,编码蛋白（PySAMS）分子量41.8kDa,长384AA。PySAMS与盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）等多种生物的SAMS具有较高的序列一致性,含有与SAMS酶活性密切相关的氨基酸残基和保守序列,与人（Homo sapiens）和大肠杆菌（Escherichia coli）的SAMS具有高度相似的三维结构。所以PySAMS与其它生物的SAMS一样,在条斑紫菜的抗逆过程中发挥重要作用。研究PySAMS有助于阐明条斑紫菜耐受非生物胁迫的作用机理,有助于获得高抗逆转基因植物。     

Effects of Oxygen on Nicotine and Tropane Alkaloid Production in Cultured Roots Duboisia myoporoides

The effects of oxygen on nicotine and tropane alkaloid production in root cultures of Duboisia myoporoides were investigated. Duboisia roots cultured in air produced both nicotine and tropane alkaloids equally. However, when roots were cultured in pure oxygen, the metabolic flux to tropane alkaloids increased, and that to nicotine alkaloids decreased. Intermediate product analysis by GC-MS showed an increase in tropine, but decreases in acetyl derivatives of tropane alkaloids and tropine esters with low-class fatty acids. Furthermore, hyoscyamine 6β-hydroxylase (H6H, EC 1.14.11.11, the key enzyme in the pathway from hyosyamine to scopolamine) also increased. These results suggest that pure oxygen contributes to scopolamine production not only by activating the biosynthetic steps for scopolamine, but also by inactivating the biosynthetic steps for nicotine and other tropine derivatives.     

红藻条斑紫菜凝集素的纯化及其色氨酸化学修饰对其活性的抑制作用

为了探索条斑紫菜凝集素(Porphyra yezoensis Ueda lectin, PYL)的作用机理,对其进行了分离和纯化．条斑紫菜经磷酸盐缓冲液浸泡、20%～75%硫酸铵分级、DEAE 纤维素52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析,得到PYL纯品. Sephadex G-200分子筛层析测得其分子量为63.2 kD,在非还原SDS-PAGE上显示1条蛋白染色带,分子量为63.1 kD,还原SDS-PAGE显示1条蛋白染色带,亚基分子量为15.8 kD．PYL在对兔、大鼠、鸡、羊、狗血细胞的凝集作用中,对大鼠红细胞的凝集活性最高.PYL在pH 6.50～10.53范围内均有活性,在pH 8.40～8.91活性最高．经42 ℃热处理10 min后,仍然对大鼠红细胞血凝活性保留12.5%,其活性最大温度范围为4 ℃～20 ℃, 48 ℃加热10 min后,其活性完全丧失．EDTA对PYL的凝集活性有抑制作用,最小抑制浓度为156 mmol/L,而 Ca2+和Mg2+未发生凝集抑制现象．PYL凝集大鼠红细胞的作用不被D 果糖、葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、菊粉、γ球蛋白、牛甲状腺球蛋白等所抑制,但可被蔗糖和麦芽糖抑制,最小抑制浓度蔗糖为20 mmol/L,麦芽糖为40 mmol/L．用N 溴代丁二酰亚胺(NBS) 对PYL分子中的Trp残基进行化学修饰,有2.1个Trp残基被修饰,修饰后PYL活性丧失, 表明Trp残基是PYL凝集活性所必需的基团．     

A METHOD FOR EXTRACTION OF HIGH MOLECULAR WEIGHT DNA FROM THE MACROALGA PORPHYRA YEZOENSIS (RHODOPHYTA)1,2

We developed a method for extraction of DNA from the red alga Porphyra yezoensis Ueda. The method consists of three preparation steps that include CsCl-gradient ultracentrifugation, cetyl trimethyl ammonium bromide treatment, and a final RNase step. The amount of DNA extracted from 1.5 g of starting material averaged 17.7 μg. The resulting DNA had a high molecular weight, was 25-166 kb in length, was digested with five common restriction enzymes, and showed no nuclease activity. It was of sufficient quality for construction of genomic libraries.