基于多酶级联协调表达策略高效催化合成 (S)-2-羟基丁酸

2-羟基丁酸 (2-hydroxybutyric acid,2-HBA) 是合成生物可降解材料和各种药物的重要中间体,化学法合成的外消旋2-HBA需要去消旋才能获得光学纯对映异构体,应用于工业。文中通过在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3) 中共表达苏氨酸脱氨酶 (Threonine deaminase,TD)、l-乳酸脱氢酶 (l-lactate dehydrogenase,LDH)和甲酸脱氢酶 (Formate dehydrogenase,FDH),构建 (S)-2-HBA的合成途径及其辅因子NADH的循环系统,实现了基于三酶级联反应催化底物l-苏氨酸合成 (S)-2-HBA。为了解决多酶级联催化反应中中间产物2-酮丁酸的生成速率和消耗率不匹配的问题,文中通过启动子工程策略来调控TD和FDH的表达水平,获得了多酶催化速率平衡的重组大肠杆菌P21285FDH-T7V7827。在5 L发酵罐水平,全细胞催化反应16 h,(S)-2-HBA的最高产量为143 g/L,摩尔转化率为97%,为迄今报道的最高产量的1.83倍,使其具有较强的工业化应用潜力。此外,结果表明,在单细胞中构建可调节的多酶协调表达系统对生物催化制备羟基酸类化合物具有重要意义。     

三酶级联催化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸

L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种重要的化工原材料和手性医药中间体,为了实现L-ABA的高效生产,本研究在大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)中分别表达大肠杆菌来源的苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase,TD)、苏云金芽孢杆菌来源的亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)和博伊丁假丝酵母来源的甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase,FDH),构建体外级联酶催化反应实现L-苏氨酸向L-ABA的转化,体系中TD、LDH和FDH添加最适比例为1∶1∶0.2。为了简化生产工艺,将3种酶在一株菌E. coli 3FT+L中共表达并实现上述配比,在30 L发酵罐中用E. coli 3FT+L全细胞转化12 h,L-ABA的产量为68.5 g/L,底物L-苏氨酸的摩尔转化率达到99.0%。该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-ABA提供借鉴。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

代谢工程改造酿酒酵母提高法尼醇产量

【目的】法尼醇(FOH,C_(15)H_(26)O)是一种具有芳香气味的非环状倍半萜醇,被广泛应用于化妆品和医学药物的工业化生产,也可作为航空燃料的理想替代品。具有食品级安全性的酿酒酵母细胞能够合成内源性法尼醇,但其产量很低,无法满足工业生产的需要。因此,需要采用代谢工程手段,改造法尼醇合成途径,以有效提高法尼醇在酿酒酵母中的产量。【方法】以酿酒酵母工业菌株CEN.PK2-1D为底盘细胞,强化甲羟戊酸途径中关键酶的表达水平和弱化麦角固醇合成分支途径,以提高法尼醇合成所需的直接前体物质法尼基焦磷酸(FPP);并分别表达催化FPP合成法尼醇的五种内源磷酸酶和两种异源合酶,筛选能高效合成法尼醇的磷酸酶或合酶。【结果】通过在CEN.PK2-1D(法尼醇产量0.1mg/L)中强化表达甲羟戊酸途径中截短形式的HMG-CoA还原酶(tHMGR1)和FPP合酶(ERG20),使法尼醇产量提高约50.8倍,达到5.08 mg/L;使用HXT1启动子替换鲨烯合酶编码基因ERG9启动子以下调其表达水平,使法尼醇产量进一步提升47.1倍,达到239.17 mg/L。在此基础上,筛选发现,表达酿酒酵母内源性磷酸酶PAH1时,获得最高产量法尼醇,达到393.13 mg/L。【结论】采用代谢工程策略对酿酒酵母法尼醇合成途径进行改造,有效提高法尼醇产量至393.13 mg/L,为目前报道的在酿酒酵母中摇瓶培养条件下的最高产量。     

(S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇北大核心CSCD

【目的】通过优化获得最佳酶活配比,设计近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CCTCC M203011的(S)-羰基还原酶Ⅱ与枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)YX-1葡萄糖脱氢酶在大肠杆菌中的共表达体系,实现重组菌高效催化2-羟基苯乙酮,合成(S)-苯乙二醇。【方法】分别从重组大肠杆菌中纯化了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶,研究了2种酶共催化2-羟基苯乙酮的最佳酶活比例,最适催化温度和pH,由此构建(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶的共表达体系。【结果】(S)-羰基还原酶Ⅱ的比酶活力为1.3 U/mg,葡萄糖脱氢酶的比酶活力为13.5 U/mg。在总酶活力为1 U时,(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶共催化体系中,确定了2种酶的最佳比例在1∶1到5∶1(U/U)之间,最适反应温度为30℃,pH为7.0。在此基础上构建了(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶基因比为1∶1的共表达体系,共表达重组菌破碎上清液中(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶酶活分别为0.76 U/mg和0.73 U/mg,两者的酶活比例为1∶1。在上述确定的最适催化条件下,其催化10 g/L 2-羟基苯乙酮,产物(S)-苯乙二醇的光学纯度和得率均高达99%以上。与仅含有(S)-羰基还原酶Ⅱ的重组大肠杆菌相比,共表达体系转化产物(S)-苯乙二醇的得率明显提高,且转化时间由原来的24 h缩短为13 h。【结论】通过确定(S)-羰基还原酶Ⅱ和葡萄糖脱氢酶最佳酶活配比,为构建手性催化的靶酶和辅酶再生酶共表达体系,为实现手性化合物的高效制备提供了研究基础。     

解淀粉芽胞杆菌关键酶基因过表达对鸟苷积累的影响

【目的】研究鸟苷生物合成途径中的3个关键酶编码基因(prs,purF,guaB)过表达对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)发酵生产鸟苷的影响。【方法】利用穿梭表达载体PBE43,构建含有prs、purF和guaB基因的单独表达载体和prs、purF基因的串联表达载体,将它们分别转入鸟苷生产菌B.amyloliquefaciens TA208后,通过实时定量PCR测定各工程菌株内相关基因的转录水平;通过酶活检测分析关键酶基因扩增对肌苷酸脱氢酶活性的影响;通过摇瓶发酵实验考察工程菌株与对照菌株的生长、耗糖和鸟苷积累情况。【结果】转录分析结果表明prs、purF和guaB基因过表达的同时都伴随着自身转录水平的显著上调。与此同时,prs和purF基因单独表达均轻微下调了嘌呤操纵子的转录水平,但是guaB基因的过表达并不影响嘌呤操纵子和prs基因的转录。酶活分析结果表明prs和purF基因扩增并不影响肌苷酸脱氢酶的活性,guaB基因的扩增使其活性提高了126%。摇瓶发酵实验发现prs和purF基因的单独过表达均未促进宿主菌合成鸟苷,而含guaB基因过表达载体的工程菌鸟苷产量较出发菌株提高20.7%。将prs和purF基因串联表达后,鸟苷产量提高14.4%,糖苷转化率增加6.8%。【结论】过表达guaB基因能够大幅提高鸟苷产量,而prs和purF基因只有实现协同表达才能对宿主菌积累鸟苷产生积极影响,为通过代谢工程技术提高鸟苷产量奠定了研究基础。     

甲醛氧化途径关键酶重组蛋白的生化特性及固定化酶吸收甲醛效果研究

甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase,ADH)与甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)是甲醛氧化途径的两个关键酶.恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PADH是一种不依赖谷胱甘肽可以把游离甲醛直接氧化为甲酸的脱氢酶,博伊丁假丝酵母菌(Candida boidinii)的FDH在有NAD+存在时可以把甲酸氧化为二氧化碳.以基因组DNA为模板用PCR方法,从P.putida中扩增出PADH基因的编码区(padh),从C.boidinii中扩增出FDH的编码区(fdh),然后亚克隆到pET-28a(+)中分别构建这两个基因的原核表达载体pET-28a-padh和pET-28a-fdh,转化大肠杆菌,利用IPTG诱导重组蛋白PADH和FDH的表达.通过优化条件使重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的70%以上,通过亲和层析法纯化出可溶性PADH和FDH重组蛋白.对重组蛋白的生化特性分析结果表明:PADH在最适反应温度50℃的活性为1.95 U/mg;FDH在最适反应温度40℃的活性为0.376 U/mg.所表达的重组蛋白与之前报道过的相比,具有更好的热稳定性和更广的温度适应范围.将PADH、FDH两个重组蛋白及辅因子NAD+固定到聚丙烯酰胺载体基质上,对固定化酶甲醛吸收效果的初步分析结果显示固定化酶对空气中的甲醛有一定的吸收效果,说明这两种酶被固定后具有开发成治理甲醛污染环保产品的潜力.     

丁醇合成途径关键酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

【目的】克隆丙酮丁醇梭状芽胞杆菌(Clostridium acetobutylicum)ATCC824丁醇合成途径关键酶基因,构建产丁醇的工程大肠杆菌。【方法】以C.acetobutylicum ATCC824基因组为模板,分别扩增丁醇合成途径关键酶基因thil,adhE2和BCS operon(crt-bcd-etfB-etfA-hbd)基因序列,构建BCS operon-adhE2-thil/pTrc99a/MG1655(pBAT)。重组菌E.coli pBAT采用0.1 mmol异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5 h,测定乙酰基转移酶(THL)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(HBD)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶(CRT)、丁酰辅酶A脱氢酶(BCD)、醛醇脱氢酶(BYDH/BDH)的酶活。并以该基因工程菌作为发酵菌种,采用好氧、厌氧和微好氧三种培养方式,检测丁醇产量。【结果】酶活测定结果显示:THL酶活达到0.160 U/mg protein,酶活力提高了近30倍;HBD酶活力提高了近5倍;CRT酶活达到1.53 U/mg protein,野生菌株无此酶活;BCD酶活力提高了32倍;BYDH/BDH酶活力无显著提高。3种发酵培养结果显示在微好氧和厌氧条件下,均有丁醇产生,且丁醇的最大产量约为84 mg/L。【结论】本实验通过构建产丁醇基因工程大肠杆菌,实现了丁醇关键酶基因在大肠杆菌中的活性表达以及发酵产丁醇,为发酵法生产丁醇开辟了一条新的途径。     

来自詹氏乳杆菌的耐热D-乳酸脱氢酶的酶学性质研究

【目的】D-乳酸脱氢酶是催化丙酮酸合成D-乳酸的关键酶。由于其不耐热,从而限制了D-乳酸高温发酵菌株的构建。本文从詹氏乳杆菌中克隆新型D-乳酸脱氢酶研究其酶学性质,为构建D-乳酸高温发酵菌株,进一步降低D-乳酸生产成本奠定基础。【方法】通过克隆詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶,将其进行体外表达,并与来自植物乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶的最适温度、最适pH、动力学参数及热稳定性和热失活性相比较,研究詹氏乳杆菌D-乳酸脱氢酶的耐热性。【结果】詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶最适温度(45 °C)比植物乳杆菌中的D-乳酸脱氢酶的最适温度(30 °C)高很多,热失活的时间和温度均要比植物乳杆菌中D-乳酸脱氢酶高很多。同时其催化效率(kcat/Km)是植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的3倍左右。【结论】詹氏乳杆菌的D-乳酸脱氢酶具有更好的耐热性和更高的催化活力。     

酶法生产L-高苯丙氨酸的研究进展

L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸,是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体,具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法,但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点,限制了广泛应用。因此,国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺,包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述,为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴,为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。     

Construction and evaluation of a novel bifunctional phenylalanine–formate dehydrogenase fusion protein for bienzyme system with cofactor regeneration

Phenylalanine dehydrogenase (PheDH) plays an important role in enzymatic synthesis of l-phenylalanine for aspartame (sweetener) and detection of phenylketonuria (PKU), suggesting that it is important to obtain a PheDH with excellent characteristics. Gene fusion of PheDH and formate dehydrogenase (FDH) was constructed to form bifunctional multi-enzymes for bioconversion of l-phenylalanine coupled with coenzyme regeneration. Comparing with the PheDH monomer from Microbacterium sp., the bifunctional PheDH–FDH showed noteworthy stability under weakly acidic and alkaline conditions (pH 6.5–9.0). The bifunctional enzyme can produce 153.9 mM l-phenylalanine with remarkable performance of enantiomers choice by enzymatic conversion with high molecular conversion rate (99.87 %) in catalyzing phenylpyruvic acid to l-phenylalanine being 1.50-fold higher than that of the separate expression system. The results indicated the potential application of the PheDH and PheDH–FDH with coenzyme regeneration for phenylpyruvic acid analysis and l-phenylalanine biosynthesis in medical diagnosis and pharmaceutical field.     

Formation of amino acid from urea and ammonia by sequential enzyme reaction using a microencapsulated multi-enzyme system

A microencapsulated multi-enzyme system has been used for the conversion of urea and ammonia into an amino acid, glutamate. The microencapsulated multi-enzyme system contains urease (E.C.3.5.1.5), glutamate dehydrogenase (E.C.1.4.1.3), and glucose-6-phosphate dehydrogenase (E.C.1.1.1.49). The conversion of urea into glutamate is achieved by the sequential reaction of urease and glutamate dehydrogenase; while glutamate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase allow for the cyclic regeneration of NADP⁺:NADPH required for the reaction. The rate of production of glutamate is 1.3 μmole per min per ml of microcapsules. The encapsulated multi-enzyme system thus allows for the sequential enzyme reaction for the conversion of urea and ammonia into an amino acid.     

凝结芽孢杆菌磷酸盐响应启动子的研究

耐热凝结芽孢杆菌因其对营养要求简单、发酵产物浓度高以及耐高温等特点,已成为乳酸发酵的主要菌种。在前期的研究中,我们发现磷酸盐可以激活凝结芽孢杆菌l-乳酸脱氢酶基因的转录,从而提高乳酸产量。然而,磷酸盐如何激活乳酸脱氢酶的基因表达,目前还不清楚,也未有类似的研究报道。【目的】对凝结芽孢杆菌响应磷酸盐的调控机制进行研究。【方法】通过RT-PCR分析磷酸盐添加时凝结芽孢杆菌乳酸脱氢酶转录水平变化,确定响应磷酸盐的关键元件区域,进一步通过分子生物学手段,分析凝结芽孢杆菌响应磷酸盐的关键基因片段。【结果】确定了响应磷酸盐的关键元件位于乳酸脱氢酶基因上游启动子区,解析了响应磷酸盐的l-乳酸脱氢酶启动子核心区,利用该启动子及核心区能够有效驱动外源d-乳酸脱氢酶基因的表达,实现在凝结芽孢杆菌中d-乳酸的合成。【结论】本研究有望获得一种新的响应磷酸盐的调控元件,为提高其他生物化学品的合成效率改造提供参考。     

Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing bacterium Mycobacterium vaccae N10

The gene of NAD⁺-dependent formate dehydrogenase (FDH) from Mycobacterium vaccae N10 was cloned into Escherichia coli by hybridization with digoxigenin-labeled DNA probes, which were prepared by amplification of the chromosomal DNA from the bacterium by the polymerase chain reaction with degenerate primers. The primers were designed on the basis of the most conserved parts of known sequences of FDH from different organisms. An open-reading frame of 1200 bp exhibited extremely high sequence similarity to the FDH gene of Pseudomonas sp. 101. The deduced amino acid sequence of FDH from Mycobacterium vaccae N10 (McFDH) was identical to that of Pseudomonas sp. 101 (PsFDH) except for two amino acid residues: isoleucine-35 (threonine in PsFDH) and glutamate-61 (lysine in PsFDH). The physicochemical properties of both enzymes appeared to be closely similar to each other, but the thermostability of McFDH was a little lower than that of PsFDH. To examine the role of the two amino acid residues in the thermostability of the enzymes, glutamate-61 of McFDH was replaced by glutaminyl, prolyl and lysyl residues by site-directed mutagenesis. All the mutant enzymes showed higher thermostability than the wild-type McFDH. The negative charge of glutamate-61 contributes to the stability of the wild-type enzyme being lower than that of PsFDH.     

丙酮酸和乙酰-CoA协同促进L-亮氨酸的合成

【目的】通过理性改造柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)、丙酮酸脱氢酶系E1p (pyruvate dehydrogenase complex,PDHC,编码基因aceE)和ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-Citrate lyase,ACL),有效供应胞内丙酮酸和乙酰-CoA,以提高L-亮氨酸产量。【方法】以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为底盘细胞,分析不同CS和PDHC酶活水平对L-亮氨酸合成的影响。随后,考查协同改造CS和PDHC或引入绿硫菌(Chlorobium tepidum)中ACL对L-亮氨酸合成的影响。【结果】低强度的CS酶活(即重组菌XL-3 P_(dapA-R2)gltA)有利于L-亮氨酸的合成,L-亮氨酸产量达到17.5±0.6 g/L。而改变PDHC酶活水平不利于L-亮氨酸的合成。此外,以启动子P_(dapA-R2)控制CS表达,而以启动子P_(gapA)控制PDHC表达时(即重组菌XL-4),可实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA的有效供给,L-亮氨酸产量达到20.2±1.7 g/L,且显著降低副产物产量。若在重组菌XL-4中引入C.tepidum,ACL会显著抑制菌体生长而不利于L-亮氨酸合成,而引入到出发菌XL-3中因胞内丙酮酸和乙酰-CoA得到有效供给,目标重组菌XL-5L-亮氨酸产量达到18.5±1.2 g/L,比出发菌株XL-3增加了14.2%。【结论】重组菌XL-4中因协同控制CS和PDHC酶活,从而实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA有效供给,促进L-亮氨酸的合成。该研究结果对后续利用代谢工程技术强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

基于比较代谢组学的理性优化方法提高阿维菌素产量

【目的】利用比较代谢组学的分析方法,研究不同发酵培养基中阿维链霉菌的胞内代谢差异,揭示合成阿维菌素的关键代谢物和代谢途径,再通过理性优化添加主要关键代谢物,提高阿维菌素产量。【方法】对M1和M2培养基中生长的菌体进行基于GC-MS的胞内代谢组学分析,通过理性添加强化前体代谢物,确定阿维菌素高产培养基。【结果】GC-MS共检测到232种物质,能够精确匹配70种胞内代谢物,通过PCA和PLS分析,最终确定了21种已知的胞内代谢物与阿维菌素的生物合成密切相关。其中乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和油脂类物质对阿维菌素的产量影响较为显著。通过单独或组合优化添加这些前体,阿维菌素的产量从5.36 g/L提高到了5.92 g/L,增加了10.4%。【结论】基于比较代谢组学分析的理性优化培养基的方法可有效提高阿维菌素的产量,并为提高当下生物基产品的产量提供了新思路。     

高浓度2-KLG对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003中2-KLG合成途径关键基因表达的影响

【目的】研究高浓度的2-KLG对其生产菌株氧化葡萄糖酸杆菌生产过程中关键的脱氢酶合成基因、辅因子合成基因及其转运蛋白编码基因的影响。【方法】测定高浓度梯度2-KLG下氧化葡萄糖酸杆菌的生长情况,确定合适的添加浓度对氧化葡萄糖酸杆菌进行胁迫。使用实时定量PCR技术检测2-KLG合成中关键山梨醇脱氢酶基因sld AB、关键辅因子PQQ合成基因pqq ABCDE及5个潜在转运蛋白合成基因的变化。【结果】根据氧化葡萄糖酸杆菌在2-KLG高浓度梯度下生长测定实验结果,选定40、80和120 g/L 2-KLG作为添加浓度。实时定量PCR结果显示,在高浓度的2-KLG压力下,PQQ合成基因pqq ABCDE未受到显著影响,山梨醇脱氢酶基因sld AB以及部分PQQ潜在转运蛋白编码基因的表达均显著下调。【结论】高浓度2-KLG会抑制氧化葡萄糖酸杆菌中山梨醇脱氢酶基因的表达,有可能会影响辅酶PQQ的转运,但不会显著影响辅酶PQQ的合成。     

Wiring step-wise reactions with immobilized multi-enzyme systems

Abstract

The immobilization of multi-enzyme systems on advanced materials is an emerging technology inspired by the spatial localization found in Nature. These systems harness the high chemo-, regio- and stereoselectivity of the enzymes and the heterogeneous nature of the resulting biocatalyst. This synergy allows more efficient and selective synthetic schemes which reduce waste production and simplify downstream processing. The revolution of the nanotechnology has contributed to design advanced materials that allow precisely controlling the spatial distribution of the different catalytic modules forming a multi-enzyme system. Outstandingly, this fact has boosted the development and the improvement of more complex cascade reactions catalyzed in vitro by heterogeneous multi-functional biocatalysts. In this review, we have discussed the different challenges that must be faced during the immobilization of multi-enzyme systems; from the carrier surface to the incorporation of cofactors into the solid-phase. We have analyzed how the physico-chemical properties of the solid materials affect the efficiency of the multi-enzyme systems and how enzymes can be co-immobilized to optimize their performance as a cascade. We have also discussed the effect of the architecture and spatial organization of the enzymes on the productivity of the system. Furthermore, we have given some clues to coordinate both activity and stability of individual enzymes to orchestrate their performance towards the necessities of the reaction cascade. Finally, we have summarized the last advances for the incorporation of biological cofactors into the solid-phase to fabricate self-sufficient heterogeneous biocatalyst that do not require the exogenous addition of those expensive cofactors. Therefore, the main goal of this review is presenting to the biocatalysis community the available tools to implement immobilized enzymatic cascades into synthetic, analytical, medical and environmental chemistry.