PTEN RNA干扰载体pSUPER的构建及功能鉴定

目的:构建抑制PTEN基因表达的pSUPER RNA干扰(RNAi)载体pSUPER PTEN并鉴定其功能。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列,靶向细胞PTEN基因的寡核苷酸链,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ双酶切的pSU-PER质粒上,构建重组RNAi质粒pSUPER PTEN,通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果;将构建正确的质粒转染肝癌HepG2细胞,免疫印迹和qPCR检测HepG2中PTEN的表达及其对AKT信号通路的影响。结果:双酶切鉴定及测序结果分析表明碱基成功插入pSUPER PTEN载体指定位点,同时序列一致;免疫印迹结果证明pSUPER PTEN载体可抑制HepG2细胞中PTEN的表达,并且提高AKT的磷酸化水平。结论:靶向PTEN的pSUPER PTEN载体构建成功,该载体能够特异性抑制PTEN基因的表达。     

针对核因子-kB P65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的:构建针对人核因子kB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA(shRNA)逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA(siRNA)靶向抑制NF-kB P65基因表达的作用.方法:根据shRNA设计原则,在人NF-kB P65全长序列中选取合19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER.retro.neo中,构建针对NF-kB P65基因的shRNA表达载体.经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞.分别采用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果.结果:限制性酶切和基因测序证实针对人NF-kB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF-kB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制.结论:成功构建了NF-kB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF-kB P65的表达.     

p21 RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的:构建抑制p21基因表达的pSUPER RNAi载体(pSUPER-p21)并鉴定其功能.方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经Bg1 Ⅱ、HindⅢ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-p21).通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果.将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达.结果:pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致.Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调.结论:靶向p21的pSUPER RNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达.     

心脏发育候选基因PYGO1 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

利用RNA干扰技术构建PYGO1基因RNA干扰(RNAi)的真核表达质粒(pSUPER-PYGO1)。首先,针对PYGO1 cDNA序列设计并化学合成一对编码短发夹RNA序列,经退火插入到由BglⅡ和XhoⅠ酶切的pSU-PER质粒上构建重组RNAi质粒pSUPER-PYGO1。通过XbaⅠ酶切鉴定及测序分析验证构建效果,将正确构建的质粒转染大鼠心肌细胞系H9c2建立产生逆转录病毒的细胞克隆。通过RT-PCR和Western blot检测pSU-PER-PYGO1对H9c2细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白的干扰效果。pSUPER-PYGO1质粒经酶切鉴定及测序分析,发现59nt寡核苷酸成功插入到预计位点,且序列完全一致;RT-PCR和Western blot检测结果显示转染pSUPER-PYGO1的细胞中PYGO1 mRNA和PYGO1蛋白量明显降低。因此,靶向PYGO1的pSUPER RNAi载体构建成功,为进一步从分子水平探讨PYGO1在心脏发育中的功能奠定了基础。     

非小细胞肺癌ROS1及其融合基因CD74-ROS1逆转录病毒载体的构建

目的:利用逆转录病毒载体pBaba-puro构建携带ROS1基因及其CD74-ROS1融合基因的重组载体pBaba-puro-ROS1,pBaba-puro-CD74-ROS1。方法:设计与合成引物,提取组织标本RNA,反转录和PCR扩增,经BamHI和TaqI双酶切,琼脂糖凝胶电泳,切胶回收进行连接转化,并再次酶切鉴定,测序分析。结果:成功构建携带ROS1基因及其CD74-ROS1融合基因的重组载体pBaba-puro-ROS1,pBaba-puro-CD74-ROS1,并通过双酶切与测序鉴定。结论:利用逆转录病毒载体基因重组技术能够成功构建出携带相应基因的逆转录病毒,可用于后续研究。     

人类成肌发育候选基因ASB12 RNAi稳定细胞系的构建与鉴定

目的:利用siRNA表达载体构建抑制人类成肌发育候选基因ASB12表达的pSUPER RNAi载体(pSU-PER-ASB12),筛选构建C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系。方法:化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向成肌发育候选基因ASB12的寡核苷酸链60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、XhoⅠ双酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒(pSUPER-ASB12)。通过酶切鉴定及测序分析检测构建效果。将正确构建的质粒转染小鼠骨骼肌细胞C2C12,通过G418筛选,免疫荧光检测,RT-PCR分析,建立稳定表达pSUPER-ASB12的细胞系C2C12-pSUPER-ASB12。结果:pSUPER-ASB12载体经酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系可表达绿色荧光蛋白,RT-PCR检测结果显示C2C12-pSUPER-ASB12细胞中ASB12表达量明显降低。结论:靶向ASB12的pSUPER RNAi载体和C2C12-pSUPER-ASB12稳定表达细胞系构建成功,为进一步从分子水平探讨ASB12在成肌发育中的功能奠定了基础。     

针对核因子-κBP65基因的短发夹干扰RNA逆转录病毒载体构建与鉴定

目的：构建针对人核因子κB亚基P65基因mRNA的短发夹干扰RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并探讨小干扰RNA（siRNA）靶向抑制NF—κB P65基因表达的作用。方法：根据shRNA设计原则,在人NF-κB P65全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pSUPER．retro．neo中,构建针对NF—κB P65基因的shRNA表达载体。经293A细胞包装,并感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定后,感染THP-1细胞。分别采用RT—PCR和Western blot从mRNA和蛋白水平检测干扰效果。结果：限制性酶切和基因测序证实针对人NF-κB P65亚基的shRNA表达逆转录病毒载体成功构建;其感染THP-1细胞后,NF—κB P65的mRNA和蛋白表达明显抑制。结论：成功构建了NF-κB P65 shRNA逆转录病毒表达载体,该载体能高效感染THP-1并明显抑制NF—κB P65的表达。     

促DNA修复多效蛋白诱导因子pprI逆转录病毒载体系统的构建及其鉴定

目的:为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的稳定遗传与表达,构建重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI。方法:将目的基因pprI亚克隆经过双酶切后定向连接到pLXIN质粒上,构建逆转录病毒重组质粒pLXIN-pprI。将pLXIN-pprI转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,氨苄青霉素筛选后抽提获得重组质粒pLXIN-pprI,双酶切及DNA测序鉴定。结果:酶切鉴定及测序结果显示结果与预期相符,pprI基因成功插入pLXIN逆转录病毒载体中。结论:重组逆转录病毒载体质粒pLXIN-pprI构建成功,为实现耐辐射球菌pprI基因在哺乳动物细胞中的重组与表达奠定了基础。     

靶向WNT5A基因的shRNA逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.方法:根据人WNT5A基因mRNA序列设计并合成两条互补的DNA单链寡核苷酸,将退火后形成的双链连接于pSUPER Retro RNAi质粒,构建WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体,经脂质体介导入GPG293细胞,包装成逆转录病毒.用该逆转录病毒感染人鼻咽癌细胞,Western blot法和RT-PCR检测细胞WNT5A的表达.结果:目的序列成功连接于载体并包装成逆转录病毒,免疫印迹检测和RT-PCR检测结果表明构建的WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体能显著抑制鼻咽癌细胞WNT5A的表达.结论:成功构建人WNT5A shRNA逆转录病毒表达载体.     

CD59、CD55在T细胞活化信号转导中的协同作用

目的：研究糖基磷脂酰肌醇（GeD）锚固蛋白CD59、CD55在脂筏介导T细胞信号转导通路中的协同效应。方法：应用siRNA技术,构建特异性针对CD55与CD59基因的重组载体pSUPER—siCD55,pSUPER—siCD59。实验分为未转染的Jurkat细胞组（I组）、转染pSUPER空质粒的Jurkat细胞组（Ⅱ组）、转染pSUPER—siCD59重组质粒的Jurkat细胞组（Ⅲ组）及转染pSUPER—siCD55重组质粒的Jurkat细胞组（Ⅳ组）。RT—PCR检测转染细胞中CD55和CD59基因的表达。噻唑蓝（MTT）比色法和激光共聚焦扫描显微镜分别检测CD55与CD59联合作用对4组Jurkat细胞的增殖效应以及细胞内钙离子的变化。结果：稳定转染后,Ⅲ组细胞CD59分子的表达和Ⅳ组细胞CD55分子的表达被成功抑制。Ⅰ组和Ⅱ组细胞CD55与CD59联合作用后增殖能力和钙离子浓度均明显高于Ⅲ组、Ⅳ组（P〈0．05）,Ⅰ组和Ⅱ组之间无差异。结论：CD59和CD55在T细胞活化信号转导通路中存在协同效应。     

小鼠Dppa2基因shRNA载体的构建及干扰效果的检测

目的:构建有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA(short hairpin RNA)干扰载体。方法:设计合成2对针对小鼠Dppa2基因的shRNA序列以及1对与哺乳动物基因组无同源性的shRNA序列作为对照,构建pSUPER.Retro.puro干扰载体并进行PCR,酶切和测序验证。进一步将各干扰载体分别转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),RT-PCR检测干扰效率。结果:PCR,酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各重组载体分别转染小鼠ESCs发现,干扰组Dppa2基因表达水平相对于空载体对照组和阴性shRNA载体对照组明显下调。结论:成功构建了有效的针对小鼠Dppa2基因的shRNA干扰载体,为进一步研究Dppa2基因在维持小鼠ESCs不分化过程中的作用提供了基础。     

p21RNAi的pSUPER载体的构建及功能鉴定

目的：构建抑制p21基因表达的pSUPERRNAi载体（pSUPER—p21）并鉴定其功能。方法：化学合成一对编码短发夹RNA序列的、靶向大鼠p21基因的寡核苷酸链,各60个碱基,退火,克隆到经BglⅡ、HindⅢ酶切的pSUPER质粒上,构建重组RNAi质粒（pSUPER-p21）。通过双酶切鉴定及测序分析验证构建效果。将正确构建的质粒转染大鼠原代培养皮质神经元,western blotting检测经红藻氨酸处理的神经元中p21蛋白表达。结果：pSUPER-p21载体经双酶切鉴定及测序分析,结果表明60个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致。Western blotting结果证实pSUPER-p21载体可特异性抑制红藻氨酸诱导的原代培养皮质神经元中p21蛋白表达的上调。结论：靶向p21的pSUPERRNAi载体构建成功,该载体可特异性抑制p21基因表达。     

hERG shRNA 表达载体构建及其稳定转染骨肉瘤细胞系MG-63、 SOSP-9607 的建立

目的:构建hERG钾离子通道蛋白(human ether-a-go-go-related gene potassium channel)shRNA表达载体质粒,获得稳定转染干扰质粒的人骨肉瘤细胞系MG-63、SOSP-9607。方法:将4对合成的寡核苷酸链退火形成双链,连接入pGPU6/GFP/Neo表达载体,并测序鉴定。使用脂质体法将重组的质粒转染至MG-63、SOSP-9607,通过G418筛选建立稳定转染的两种细胞系,采用免疫印迹(Western blot)技术检测hERG蛋白的表达。结果:测序结果证实shRNA与载体连接正确,免疫印迹实验证实hERG蛋白表达显著降低。结论:成功构建了hERG shRNA真核表达载体,获得了稳定表达hERG shRNA的人骨肉瘤细胞系MG-63和SOSP-9607。     

结核分枝杆菌Rv3586结构域基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)环二腺苷酸(cyclic diadenosine monophosphate,c-di-AMP)合成酶Rv3586结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法:以Mtb基因组为模板PCR扩增Rv3586三个结构域基因,分别克隆入pEGFP-N3真核表达质粒,用菌落PCR、质粒酶切和测序方法对插入序列进行鉴定。通过脂质体将重组质粒转染COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因在COS-7细胞内的表达。结果:PCR成功扩增出Rv3586三个结构域基因,菌落PCR、质粒酶切和质粒测序鉴定结果表明成功插入目的片段,包含Rv3586的三个结构域基因的真核表达载体构建成功。间接免疫荧光法结果显示,Rv3586三个结构域蛋白在COS-7细胞中表达成功。结论:成功构建Rv3586三个结构域基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达成功,为后续Mtb Rv3586结构域的功能和应用研究奠定了基础。     

白细胞介素-21与乙型肝炎病毒前S2S抗原融合蛋白在293T细胞中的表达

目的:构建白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)和乙型肝炎病毒前S2S抗原(S2S)的融合表达质粒,并研究其在293T细胞中的表达。方法:采用PCR方法扩增IL-21和HBV前S2S基因片段,分别克隆入pcDNA3真核表达质粒,用分子克隆方法构建融合表达质粒,并以脂质体2000转染293T细胞,分别应用ELISA法和Western Blot法检测细胞上清及细胞中IL-21和HBsAg的表达水平。结果:经酶切鉴定及DNA序列证实重组质粒内插入片段序列正确,三种重组质粒分别命名为pcDNA-IL-21、pcDNA-S2S和pcDNA-IL-21-S2S,并且重组质粒能在293T细胞内表达并分泌相关蛋白。结论:成功构建IL-21和乙型肝炎病毒前S2S抗原的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

转录因子Sp1上调前列腺癌细胞中CD59的表达

目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1时CD59表达的影响.方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418筛选建立稳定表达转染基因的细胞株,Western blotting检测转染细胞中sp1和CD59基因的表达,MTT和染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用.结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体,转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的Pc-3细胞Sp1及CD59基因蛋白水平降低,MTT和染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低.结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础.     

嵌合内含子对抗bFGF抗体基因在293T细胞中表达的影响

目的：构建含嵌合内含子和抗bFGF抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中表达,探讨嵌合内含子对抗体表达的影响。方法：设计引物分别从载体pCl-neo和pComb3-Fab25中扩增出内含子和抗体Fd段、κ链基因序列,按不同组合构建到含人免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段基因的表达载体pIgG中。重组质粒经脂质体PEI转染293T细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,采用夹心ELISA和Western blot检测细胞上清中抗体的表达。结果：DNA测序和酶切分析表明,内含子和抗体基因成功插入pIgG,获得了重组质粒pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron。倒置荧光显微镜下可观察EGFP大量表达,Western blot分析上清中有抗体的表达,夹心ELISA检测pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron抗体表达量分别为1.21mg/L、0.468mg/L、7.39mg/L、0.601mg/L。结论：成功构建了含嵌合内含子和抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中得到表达。嵌合内含子插入κ链基因5’端可提高抗体的表达,插入Fd段5’端则抑制抗体的表达。     

重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING,并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体,为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL,抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物,扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域,通过重组PCR,将SH2分别与U—box、RING进行融合,融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK293T细胞,Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp,SH2一RING大小为633bp,重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING,转染HEK293T细胞后能够正确表达,为后续研究奠定了基础。     

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PTB分别与U-box、RING进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG-CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HeLa细胞,Western 印迹验证重组质粒的表达.结果 PCR结果显示PTB-U-box条带大小840 bp,PTB-RING大小为620 bp,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论 成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4-PTB-U-box和 pFLAG-CMV4-PTB-RING,并且转染HeLa细胞后证实其能够正确表达.     

重组泛素连接酶tTRIP-U-box的构建与表达

目的：构建重组泛素连接酶tTRIP-U-box,并克隆进入pFLAG—CMV4真核表达载体,为研究通过靶向降解接头蛋白TRAF（TNFReceptorAssociatedFactor）家族蛋白,从而抑制破骨细胞活性提供基础。方法：分别设计引物,扩增tTRIP（TRAF-interactingprotein）分子C端伸展的coiled．coiled结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box结构域,再利用重组PCR,将tTRlP与U-box进行融合,双酶切之后将其插入真核表达载体pFLAG．CMV4,经过酶切鉴定及测序后,转染HEK-293T细胞系,Western印迹验证重组质粒的表达。结果：PCR结果显示tTRIP截短分子和tTRIP—U-box条带大小分别为660bp和1188bp,重组质粒经酶切鉴定和测序证实正确,转染后可见融合蛋白的表达。结论：成功构建真核重组表达载体pFLAG-CMV4一tTRIP-U—box,并且转染HEK-293T细胞系后证实其能够正确表达。