交联脲酶聚集体的制备和初步应用

为提高游离脲酶的稳定性,将游离脲酶用硫酸铵沉淀下来后,以戊二醛作为交联剂对其进行化学交联,制备新型的固定化脲酶交联脲酶聚集体,并对其酶学性质进行研究。交联脲酶聚集体的最适pH、最适温度和K_m值分别为：pH 8.0、70℃和0.021 mol/L。在对交联脲酶聚集体的热稳定性,储存稳定性,和对抗蛋白水解酶的能力的研究中,交联脲酶聚集体均显示了比游离脲酶更高的稳定性。为考察其使用效果和稳定性,将其与包醛氧淀粉联合,用于慢性肾衰动物模型的口服治疗。以腺嘌呤灌胃法(每天300mg/kg, 共30d)制备慢性肾衰动物模型,将23只大鼠随机分为模型对照组(每天以10mL/kg蒸馏水灌胃)、单纯包醛氧淀粉组(给予含包醛氧淀粉饲料,10mL/kg蒸馏水灌胃)和包醛氧淀粉+交联脲酶聚集体组(给予含包醛氧淀粉饲料,交联脲酶聚集体悬浮液10mL/kg灌胃),经2周治疗后, 模型对照组、治疗对照组和治疗组实验前后的肌酐含量均有小幅下降,但差异不显著(P值分别为0.922、0.972和0.225＞0.05)。模型对照组的尿素氮含量变化不明显(P=0.211＞0.05)。治疗对照组和治疗组实验前后的尿素氮含量均明显下降(P值分别为0.004和小于0.001,均小于0.01)。治疗对照组和治疗组实验前后的尿素氮含量下降量比较,有显著性差异(P=0.016＜0.05)。治疗组尿素氮含量下降更明显。说明交联脲酶聚集体和包醛氧淀粉联合使用时,对尿素的清除效率比单纯使用包醛氧淀粉更高。     

黄单胞菌多糖20吨罐发酵

野油菜黄单胞菌（Xanthomonascampestris）L4在20t发酵罐中,以蔗糖为底物发酵72h,发酵液粘度达到7000～9500cp,产物对底物的转化率平均达到61．6％,为投产奠定了良好的基础。     

重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin）大肠杆菌表达体系发酵条件的优化

优化了重组人血管内皮抑制素的E. coli表达体系的发酵条件。利用E. coli表达体系得到了较高的产量,在9h左右的发酵周期内达到OD600值140,包涵体蛋白产量为3 g/L。主要优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）的终浓度、诱导时间、培养温度、补料控制方法等条件,并且在诱导后提高培养温度到40℃,在非常短的培养周期内达到了高密度培养的目的。利用E. coli表达,继而通过复性获得有活性的重组人血管内皮抑制素,成本低、生产过程稳定可控、得到的蛋白性质稳定,符合工业生产的需要。     

低高径比喷射环流生化反应器流体力学和发酵性能的研究

对高径比s≤2．5喷射环流生化反应器的流体力学和传质特性进行了系统的研究,选出反应器的最佳结构,关联出氧的体积传递系数(k_La)表达式。在此基础上,进行了谷氨酸发酵试验,摸索出用该设备进行各氨酸发酵的最佳工艺条件,使5批一次性投糖发酵的糖酸转化率达到50％以上。     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因appA,按照毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA-m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southern blotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中,并确定了整合基因的拷贝数。Northern blotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到2.5mg/mL发酵液, 酶活性(发酵效价)达到7.5×10⁶IU/mL发酵液以上, 大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

黄单胞菌多糖发酵中试*

野油菜黄单胞菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）Ｌ４在两吨发酵罐中,以蔗糖为底物发酵７２ｈ,发酵液粘度达到６０００～１２０００ｃｐ,转化率平均达到６２．４５％。     

肌苷产生菌枯草杆菌7171-6-1菌株的选育

本文报告由枯草杆菌(Bacillus subtilis) No．101野生型为出发菌株,经过硫酸二乙酯(Dicthyl Sulfate,DES)、8-氮杂鸟嘌呤(8-Azagnaninc,8-AG)处理获得了一株腺嘌呤、硫胺素双重营养缺陷型突变株7171-6-1,在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中,经60—72小时、30—32℃发酵,肌苷产量达11．65克／升。     

酵母菌杂交育种IV．高产酒精酵母杂交育种

用显微操作技术进行 Saccharamyces cerevisisae 系 2.576 (mel-)与 S. carlsbergensis 2．500 (MEL+)以及 S．Cerevisisae Stole 系(mel-)与S. microelltpsoides 2.699—2—3(MEL+)种间杂交。获得的杂种能全发酵棉子糖,而亲株只系与Stolc系仅能发酵此糖1／3。两个不同杂交系的杂种H808与H824-14用孢子×孢子交配法进行杂交,所有的杂种酵母H868、H869,H875和H876发酵糖蜜醪比生产菌株日系及Stole系快。H875菌株生成酒精量比其亲株高3一10％。将H875菌株与生产菌株S. cerevisiae DT菌系杂交,获得H946和H948两株杂种,其中H948酒精发酵力比DT系高3％,比H875高2％,是一株酒精生产优良新品系。     

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D 泛解酸内酯水解酶的菌株 ,经鉴定为串珠镶孢霉菌 (Fusariummonili forme)SW 90 2。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始pH8 0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L发酵罐中通风发酵 45h ,产菌丝体生物量 7 1 8g干菌体 L ,D 泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 92IU g干菌体     

温度对丙酮酸生物合成动力学、能荷和氧化 还原度的影响

在光滑球拟酵母（Torulopsis glabrata 620）生产丙酮酸的过程中,温度对丙酮酸生物合成有着重要的影响。考察了不同发酵温度下基质消耗、细胞生长、丙酮酸合成及能荷水平和氧化还原度等方面的差异。在恒温发酵中,维持较高的发酵温度可以增强糖耗,促进菌体生长,加速丙酮酸积累,但前期胞内能荷水平较高,菌体消耗较多葡萄糖合成菌体,后续产酸能力不足,导致丙酮酸得率降低;维持较低的发酵温度可以在发酵后期提供稳定的产酸能力,但菌体代谢缓慢,后期胞内NADH/NAD⁺水平较高,丙酮酸生产强度降低。因此仅仅采取单一的温度控制策略很难达到丙酮酸高产量、高产率和高生产强度的统一。     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

真菌硬葡聚糖的生产及在油田上的应用

真菌小核菌 (Sclerotiumspp )产生一种新型非离子型抗盐抗温生物多糖聚合物 硬葡聚糖。综述了该糖的生产 ,发酵条件对生产的影响 ,及其在油田上的应用。     

固定化酵母细胞流化床反应器的 操作与嫩啤酒双乙酰水平

利用海藻酸钠固定化酿酒酵母细胞和流化床生物反应器进行介质循环发酵。反应器中固定化胶体最适体积分数(φ)为O．40(v／v)。在给定固定化胶体体积分数(φ=O．40),给定发酵温度(10℃)和循环比(n=5)的条件下,研究了循环流速对主发酵周期和对嫩啤酒双乙酰水平的影响。结果表明,发酵周期随流速的增加而减少,而双乙酰浓度则随流速的增加而提高。当停留时间τt=2．8h,发酵周期T(=nτ r)为14h,嫩啤酒中双乙酰浓度为0．5ppm。     

纤维素酶在木质纤维素生物质转化中的应用研究

选育得到纤维素酶高产菌株里氏木霉突变菌株(Trichoderma reesei) 813A,优化了其发酵产酶条件。利用该菌株所产纤维素酶对天然木质纤维素的水解糖化过程进行研究,确定了实验条件下最优的糖化条件(温度50℃, pH 4.5,酶浓度6～8 FPU/mL,底物浓度2%)。以玉米叶和杨树叶为天然纤维素原料,水解糖化率分别达到86.2％和56.0%。通过酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)将糖化液转化为酒精,产乙醇浓度达到 5%～5.8%,转化率为79.4%～92.1%。     

hprK 基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应（CCR）及糖吸收 的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A（CcpA）可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS）是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P 磷酸酶（HprK/P）参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,K96SRQ 的激酶活性受1,6二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P.HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶I在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24Al/Pmx45 的HprK/P 编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/Pmx45.摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/Pmx45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24Al/Pmx45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/Ml,比24Al/Pmx45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效 应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。     

固定化酵母细胞流化床反应器的 操作与嫩啤酒双乙酰水平

利用海藻酸钠固定化酿酒酵母细胞和流化床生物反应器进行介质循环发酵。反应器中固定化胶体最适体积分数(φ)为O．40(v／v)。在给定固定化胶体体积分数(φ=O．40),给定发酵温度(10℃)和循环比(n=5)的条件下,研究了循环流速对主发酵周期和对嫩啤酒双乙酰水平的影响。结果表明,发酵周期随流速的增加而减少,而双乙酰浓度则随流速的增加而提高。当停留时间τt=2．8h,发酵周期T(=nτ r)为14h,嫩啤酒中双乙酰浓度为0．5ppm。     

假丝酵母发酵玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇

采用一株驯化过的假丝酵母(Candida sp.)直接发酵经过简单脱毒处理的玉米芯半纤维素水解液生产木糖醇。确定了水解液的最适浓缩倍数在3.0～3.72的范围内。利用正交实验,确定了摇瓶分批发酵工艺条件的最适组合为：摇床转速180r/min,起始C/N为50,起始pH 5.5,接种量5% (体积比)。在此基础上,重点研究了在发酵罐中通气量对酵母发酵玉米芯水解液生产木糖醇的影响。结果表明采用先高后低的分段通气发酵在木糖醇得率方面明显优于恒定通气发酵;其中,在0～24h,3.75 L/min;24～108h,1.25 L/min的分段通气条件下(装液量为2.5L),木糖醇得率(木糖醇/木糖,g/g) 达到0.75 g/g。该结果将有助于建立一种高效的、大规模的利用玉米芯半纤维素水解液发酵生产木糖醇的工艺。     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL11生产重组人细胞白介素-3

在B.Braun ES-10型15L和NBS BioFlo 3000型5L发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒pSBHL-11的大肠杆菌YK537,生产重组人白细胞介素-3(IL-3),发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在30%～40％左右、30℃生长11h,42℃诱导培养4h,能将发酵液中最终菌体密度从OD₁₆600提高到OD₅₃600(相当于每升发酵液含106克湿菌体),并且保持了白细胞介素-3的表达量,占菌体总蛋白的30%左右,含量超过3.3%g/L,使IL-3包涵体产量从湿重2.2g/L提高到8.5 g/L,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到70%以上。     

Agrobacterium tumefaciens OAH-01产脲酶发酵培养基优化

氨基甲酸乙酯( EC)是大多数发酵制品中的潜在致癌物,而尿素是EC的最主要前体物质之一,因此需要采取相关措施控制发酵制品中尿素的含量。向酒体中添加脲酶具有安全、高效和处理条件温和等优点,是FDA推荐的降低EC 含量的优先方法。微生物是脲酶的主要来源,可利用其实现脲酶的大规模生产。本文以产脲酶根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens OAH-01为研究对象,考察了该菌株的生长曲线和产酶曲线,证明该菌株产脲酶属生长关联型,且能在较短时间内达到最大产酶量,此外还研究了发酵培养基组成对该菌发酵产酶的影响,通过单因素及正交试验优化确定了最佳发酵培养基组成(g/L)：蛋白胨20,酵母粉5,葡萄糖5,FeCl30.54,Na2HPO40.5, KH2 PO40.5,NiSO40.1,起始 pH 7.0。在最适条件下发酵16 h,菌悬液中脲酶酶活可达1.077 U/mL,为优化前的2.4倍。超声破碎后细胞上清中的脲酶活性为0.419 U/mL,为优化前的4.4倍。     

营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响

丙酮酸是多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体,广泛应用于化工、制药及农用化学品工业。能够直接发酵生产丙酮酸的菌种主要有Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ[1],Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ[2],Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ[3],Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ[4],Ａｇａｒｉｃｕ?..