化学发光Southern blot法检测HBV体外复制及其应用于药物对HBV的抑制分析

目的：建立化学发光Southern blot检测细胞内HBV DNA的方法,同时检测3种不同靶点抗乙肝药物的体外作用。方法：用地高辛标记HBV探针,优化杂交条件,检测来自HepG2及HepG2.2.15 HBV DNA复制中间体;利用建立的化学发光Southern blot检测HBV DNA的方法检测经拉米夫定、Bay41-4109、α-Galcer以不同药物浓度处理的HepG2.2.15HBV DNA复制中间体的水平。结果：（1）标记的HBV探针的检测灵敏度为0.1pg,杂交系统的检测灵敏度为1pg,可检测到HepG2.2.15细胞内的HBV DNA特异性信号;（2）以该法检测胞内HBV DNA可见3种药物都有明显的抑制作用,其半数有效量（IC50）分别为1.53μmol/L、0.41μmol/L、0.01μmol/L。结论：胞质HBV DNA的水平能准确地反映不同靶点抗HBV药物的抗病毒效果,建议在观察药物特别是中药抗病毒研究中采用。     

HBV DNA环化结构在体外的复制表达水平优于HBV线性结构的表达质粒

为了研究乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA环化结构与HBV线性结构的表达质粒在体外复制表达水平的差异,采用3种含有HBV全长DNA的表达质粒与自连环化的HBV DNA分别转染Huh7细胞. 5 d后收集转染处理过的Huh7细胞和细胞上清,从感染细胞中抽提纯化HBV复制中间体进行Southern印迹分析,并将细胞培养上清进行ELISA分析.结果显示,HBV DNA通过环化后转染Huh7细胞,可高效地进行转录和复制表达,且优于质粒转染的效果.证明在细胞中,HBV DNA环状结构的复制表达能力优于HBV线性结构的表达质粒.     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

KNK437抑制乙型肝炎病毒复制及转录

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)在肝细胞内复制过程中,病毒反转录酶(P蛋白)与前基因组RNA(Pregenomic RNA,pgRNA)上的RNA包装信号ε形成P-ε复合物,启动反转录合成和核衣壳装配。封闭P-ε相互作用是一种极具吸引力的抗HBV策略。已知P-ε形成RNP复合物正常发挥活性时,需要热休克蛋白(Heat-shock proteins,Hsps)参与。本研究探索Hsps抑制剂KNK437对HBV复制及转录的影响。主要运用了三种工作模型:HepG2.2.15细胞系、瞬时转染1.05×HBV(pCH9-3091)质粒的Huh7细胞系和瞬时转染1.3×HBV(pGEM-1.3×HBV)质粒的Huh7细胞系。采用CCK-8方法检测KNK437的细胞毒性,ELISA测定细胞培养液上清中HBsAg和HBeAg的分泌水平;q-PCR和qRT-PCR分别检测细胞内HBV核衣壳中DNA和细胞内HBV RNA水平;Western blotting检测细胞内衣壳亚单位(core)表达水平;qRT-PCR检测细胞内Hsps本身的转录水平。结果表明:20μM KNK437对细胞没有毒性,且在该浓度下KNK437除HepG2.2.15模型外,均下调HBV HBsAg和HBeAg的胞外分泌,抑制细胞内HBV核衣壳中DNA合成,降低细胞内HBV RNA转录水平,最低可使DNA水平降至1.5%左右,RNA水平降至30%左右,从而表明KNK437抑制HBV复制和转录。在HepG2.2.15中的Western blotting显示,KNK437明显减少细胞内衣壳亚单位(core)表达水平。KNK437也抑制Hsp70,Hsp90b,Hsp40等三种热休克蛋白RNA的转录,从而验证了它的确是一种泛Hsps抑制剂。本研究结果显示KNK437具有潜在抗HBV应用前景。     

联合应用siRNA和拉米夫定抑制HBV复制和表达的实验研究

观察联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HepG2.2.15细胞中HBV抗原表达和复制的抑制作用。构建并转染重组质粒psil-HBV到HepG2.2.15细胞中。转染后的细胞培养基中加入拉米夫定(0.05μm),分别于48、72、96 h收获细胞。用ELISA方法检测HBeAg和HBsAg;HBV DNA水平用实时定量PCR测定;用逆转录PCR检测HBV mRNA水平。96 h后联合应用小干扰RNA和拉米夫定组细胞培养上清中HBeAg和HBsAg抑制率分别为91.8%和82.4%(P<0.05);HBV mRNA表达水平明显降低。HepG2.2.15细胞中联合应用小干扰RNA和拉米夫定对HBV复制的抑制作用比单独应用siRNA或拉米夫定更有效。     

慢性乙型肝炎病毒感染病毒复制与肝细胞内质网应激反应相关性的初步研究

目的:研究体内、体外乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制水平与肝细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)反应基因表达的相关性。方法:选择7例慢性HBV感染者作体内研究,用液氮冷冻保存肝脏穿刺活检组织,检测肝功能并提取m RNA;体外研究分三组,转染组(HepG2.2.15)为HBV基因转染人肝癌细胞株,对照组(HepG2)为人肝癌细胞株,干预组(3TC)为50μg/m L拉米夫定作用于HBV基因转染人肝癌细胞。分别培养2天、4天、6天后收集细胞提取m RNA。HBV DNA载量的测定用实时定量聚合酶链反应(PCR);活化转录因子4 (ATF4)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)、活化转录因子6(ATF6)、X盒结合蛋白1(XBP1)及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的m RNA表达,用SYBR Green荧光定量逆转录聚合酶链反应(SYBR Green RT-PCR)检测,以β-actin为内参照;GRP78的表达用蛋白免疫印迹法(WB)检测。结果:体内研究结果表明:XBP1、GRP78、CHOP及ATF6基因表达水平与病毒载量、炎症程度及肝组织纤维化程度无显著相关性(P0.05);ATF6与GRP78基因表达水平和HBV DNA水平呈显著正相关(P0.05)。体外研究结果表明:干预组细胞培养2天至6天HBV DNA水平下降,CHOP、GRP78、ATF6及XBP1基因表达水平在三组之间差异无统计学意义(P0.05);WB结果表明,转染组细胞GRP78的表达培养4天与6天相比差异无统计学意义(P0.05),干预组培养6天后与转染组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:研究结果提示体内HBV复制水平与肝细胞ER stress反应显著相关,而肝脏炎症程度及肝脏纤维化程度等与ER stress反应无明显相关性;体外三组细胞之间ER stress基因的表达无显著差异(P0.05)。     

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。     

反基因锁核酸体外阻断乙肝病毒前S2基因表达

目的:探讨针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用.方法:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区,分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以半乳糖配体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)、时间分辨免疫荧光技术(TRFIA)和酶联免疫法(ELISA)分别监测1、3、5和7d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S2抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测锁核酸对细胞代谢的影响.结果:加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S2抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7d后抑制率分别达61.56％、68.18％和72.82％.各实验组与对照组比较差异均具有统计学意义(均P＜0.05).LNA对细胞代谢无明显影响.结论:针对乙肝病毒前S2基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据.     

磷脂爬行酶1对干扰素抑制乙型肝炎病毒(HBV)作用的影响

研究磷脂爬行酶1(Phospholipid scramblase 1,PLSCR1)对干扰素抑制HBV作用的影响。设计合成PLSCR1特异性小干扰RNA(siRNA),以完全随机序列的阴性小干扰(NCsiRNA)作为对照,转染HepG2细胞,于转染48h后分别检测PLSCR1mRNA和蛋白水平表达量的变化,筛选出对PLSCR1具有沉默作用的siRNA;将HepG2细胞分为正常对照组和干扰素处理组,将1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因真核细胞表达载体HBV1.3质粒分别与PLSCR1siRNA或NCsiRNA共同转染HepG2细胞或干扰素处理的HepG2细胞,转染48h后检测各组细胞中PLSCR1mRNA表达量及培养液上清中HBsAg表达水平。PLSCR1特异性小干扰RNA siRNA911转染后能够显著抑制HepG2细胞中PLSCR1基因在mRNA和蛋白水平的表达;与HepG2细胞对照组比较,干扰素处理组细胞转染HBV1.3质粒、NCsiRNA+HBV1.3质粒后,细胞培养液中HBsAg表达水平均显著降低(P0.05);而PLSCR1siRNA与HBV1.3共转染IFN处理的HepG2细胞组与共转染HepG2细胞组相比较,细胞培养液中HBsAg的表达水平没有显著差异。提示抑制PLSCR1的siRNA可抑制干扰素的抗HBV活性,提示PLSCR1在干扰素抑制HBV复制中具有重要作用。     

干扰素在肝癌细胞Huh7.0中诱导SAMHD1抑制HBV复制

目的:研究干扰素调节宿主限制性因子SAMHD1的表达而抑制HBV复制的分子机制。方法:首先不同剂量的干扰素α、β和γ处理Huh7. 0细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测SAMHD1在转录和翻译后的表达水平;进一步通过siRNA干扰内源性的SAMHD1,再评价干扰素α、β对病毒的抑制效应;最后通过免疫荧光检测了干扰素α诱导内源性SAMHD1的细胞定位及Southern blot检测了SAMHD1细胞定位对病毒复制的影响。结果:在Huh7. 0细胞中,SAMHD1的RNA水平和蛋白表达明显受干扰素α和β的诱导升高;干扰SAMHD1后干扰素α和β对HBV复制的抑制作用消失; SAMHD1定位在细胞核内,干扰素α诱导SAMHD1同样定位在细胞核内,缺失核定位信号后SAMHD1丧失了其抑制病毒复制的作用。结论:在Huh7细胞中,干扰素α、β能诱导SAMHD1表达上调来抑制HBV的复制,SAMDH1的抗病毒作用依赖于其细胞定位。