TAIL-PCR的改良及其在分离小麦基因启动子中的应用

在经典TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)的基础上, 对其进行了如下四处改进: 用10个碱基的RAPD引物代替16个碱基的随机兼并引物作为PCR中的随机引物; 将较低特异性循环的复性温度由44°C降至29°C; 增加5个高特异性反应循环, 减少5个较低特异性反应循环; 用单引物对第三轮PCR产物进行初步鉴定。利用改进的TAIL-PCR方法分离了小麦X基因的5′未知的侧翼序列, 与GUS基因融合后转入拟南芥, 通过组织化学检测分析表明分离到的5′侧翼序列具有启动子功能, 同时说明改进的TAIL-PCR能更好地应用到较复杂基因启动子的分离。     

转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点的研究

主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Junction PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性．结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为：log₂N (拷贝数) =-0.935 4ΔCt + 3.411 6 (R²=0.997 4,P < 0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85 ± 1.77和18.87 ± 1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1 (1 440 bp)、TgInS2 (1 263 bp)和TgInS3 (1 861 bp) 3个整合位点．以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性．采用整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子．初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础．     

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术.该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应,选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增.TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行,反应高效灵敏,产物特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经在分子生物学研究领域广泛应用.本文从TAIL-PCR技术原理出发,对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述,并介绍TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景.     

甘蔗 UGPase 5’侧翼序列克隆及缺失表达分析简

以甘蔗(FN95;-1702)为材料,通过接头连接PCR方法克隆该基因不同长度5′侧翼序列。将不同长度的5′侧翼序列连同UGPase基因的外显子片段定向插入到GUS基因上游,在保证其后GUS编码框不发生偏移的情况下,插入的UGPase外显子融合GUS表达成为新的报告基因。根据此策略,构建了一系列表达结构为5′ Flanking Sequence-UGPase Exon-GUS-Nos polyA的5′侧翼序列缺失表达载体,进行启动子活性分析。注射法转染烟草叶片组织检测GUS瞬时表达,分析结果表明,所克隆到的UGPase基因5′端侧翼序列不具有启动子活性。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

ggpps 5′-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的：研究栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs）基因启动子的活性;方法：从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5′-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果：本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5′-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论：ggpps基因的5′-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5′-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础。     

香蕉RAPD分析初步研究

比较了不同提取方法对香蕉植株不同部位组织提取 DNA的质量及其 PCR扩增结果 ,对香蕉 RAPD分析中引物种类和浓度 ,复性温度 ,d NTPs,Taq DNA聚合酶浓度 ,热循环数等因素进行了比较影响分析。结果表明 ,虽然改良的 SDS法、CTAB法和 PVP法提取的植株嫩叶和吸芽 DNA提取量和纯度各不相同 ,但其 PCR扩增结果基本相同 ;相同克隆不同植株的 DNA其 PCR扩增结果也基本相同 ;建立了适合香蕉大规模 DNA多态性分析 RAPD反应体系 :2 5 μL反应液中 ,含 1倍缓冲液 ,0 .2 m Md NTPs,0 .3 2 p M随机引物 ,IUTaq酶 ,2 0 ng模板 DNA;反应循环数为 45 ,热循环条件为 94°C,1 min;3 7°C,1 min;72°C,1 .5 min;之前为 94°C,5 min;之后为72°C,1 0 min。在筛选的 2 49个随机引物中 ,有 1 8个在 7个品种上都能扩增出 3～ 1 0条比较清晰条带。     

甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A和B启动子的克隆

几丁质不仅是昆虫的表皮和围食膜的主要成分,也是一个非常关键的害虫控制靶标,主要通过几丁质合成酶（chitin synthase,CHS）基因合成。本文在克隆甜菜夜蛾Spodoptera exigua的两个几丁质合成酶基因（SeCHSA和SeCHSB）cDNA和基因组序列的基础上,从基因的5′末端设计特异性引物和构建特定的基因组文库, 采用PCR的方法获得了5′端侧翼序列。通过5′RACE的方法确定SeCHSA和SeCHSB基因的转录起始位点后,获到了启动子序列。这为研究昆虫几丁质合成和转录调控奠定了基础。     

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.     

番木瓜proteinase omega基因启动子的克隆及功能初步研究

采用PCR技术从番木瓜基因组中克隆了proteinase omega基因的部分序列及其5′侧翼序列。序列分析表明,克隆到的基因序列与GenBank中的序列同源性为96%,长1039bp的5′端侧翼序列在GenBank数据库中没有同源片段。预测5′端侧翼序列有两处基础启动子区域,转录起始位点(TSS)分别为是A,T。在基础启动子区域都存在TATA-box,上游发现多处CAAT-box,G-box,I-box等顺式作用元件和AT富含区。构建了植物表达载体并用基因枪轰击番木瓜的叶组织,GUS基因瞬间表达结果表明,该长1039bp的5′端侧翼序列具有驱动GUS基因在乳管中表达的功能。该启动子的发现对进一步研究启动子的功能和开发番木瓜作为生物反应器具有重要意义。