Exendin-4类似物的克隆、表达与体内生物活性检测

为研究Exendin-4类似物的克隆,融合表达及在体内的生物活性,在pED载体融合伴侣序列中插入利于下游分离纯化的序列成为5#载体,将Exendin-4类似物基因与5#载体中的融合伴侣基因通过酸水解位点连接,转化至E.coli BL21中并诱导表达融合蛋白,酸水解将目的肽与融合伴侣分开后,经阴离子交换树脂分离得到目的肽。6周～8周正常雄性ICR小鼠皮下注射Exendin-4类似物后,口服糖耐量实验检测在不同时间段小鼠血液中葡萄糖及胰岛素含量的变化。结果表明:融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的40%,Exendin-4类似物纯度达91.8%。Exendin-4类似物的活性与对照组相比,具有显著的降低血糖和显著促进胰岛素分泌的活性(P<0.01)。     

Exendin-4的固相化学合成及鉴定

Exendin-4是首个获准上市的肠促胰素类似物药物,可模拟人体自身激素GLP-1的功能,不仅改善血糖,还能促进胰岛β细胞新生、增殖,抑制β细胞凋亡,改善β细胞功能,促进胰岛素分泌,增加机体对胰岛素的敏感性。根据Exendin-4的潜在市场价值,以Fmoc固相合成策略为基础,NMP为反应溶剂,以HOBt/DIC为缩合剂,添加盖帽程序,优化合成工艺条件。肽树脂裂解采用TFA/Phenol/TIS裂解液,并应用高效液相色谱和四级杆-飞行时间串联质谱对其进行分析鉴定和纯化,最终获得Exendin-4,产率为21%,纯度为99.4%。活性测定结果显示,合成的Exendin-4显著提高胰岛瘤细胞的活性,并呈一定剂量依赖性。     

Exendin-4的研究进展

Exendin-4是从希拉毒蜥唾液中分离的一种多肽激素,由39个氨基酸残基组成,与胰高血糖素样肽1（GLP-1）有53%的同源性.Exendin-4具有高度的组织特异性,仅在希拉毒蜥的唾液腺中表达.Exendin-4首先翻洋成N端多余45个氨基酸残基的前体,然后在激素原转化酶催化下分解产生具有生物活性的Exendin-4.Exendin-4的N端是一段不规则卷曲,第7～28氨基酸残基形成α螺旋,C端是不规则亲水片段.Exendin-4的受体是G蛋白,N端是激活受体信号转导途径的关键区域,中间部位和C端是受体结合域.Exendin-4与GLP-1类似,可提高胰岛素基因的转录水平,刺激胰岛素的释放,从而控制血糖浓度,但GLP-1的半衰期2分钟,Exendin-4半衰期却长达9.57小时,因而在治疗Ⅱ型糖尿病方面具有广阔的前景.     

长效GLP-1受体激动剂的研发进展

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like Peptide-1,GLP-1)是机体在葡萄糖等刺激下释放的一类肠促胰岛素。GLP-1具有促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌,促进胰岛β细胞增殖并抑制其凋亡、抑制摄食、减慢胃排空和减轻体重等作用。GLP-1在体内极不稳定,易被二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)降解,半衰期短。从墨西哥巨蜥蜴唾液中分离得到GLP-1的天然类似物Exendin-4与其有着相似的作用,且不易被DPP-IV降解。以GLP-1及Exendin-4为基础,研发长效GLP-1受体激动剂,已成为研发新型糖尿病治疗药物的热点之一。本文就长效GLP-1受体激动剂的研发现状予以综述。     

长效化Exendin-4的研究进展

Exendin-4是一种新型GLP-1类似物,已被用于2型糖尿病的治疗。由于其优良的药学特性成为糖尿病治疗的亮点,而进一步开发设计长效Exendin-4药物成为近年2型糖尿病药物研究的热点。本文就长效Exendin-4药物的国内外研究进展、作用机制以及药效学性质做一综述。     

Exendin-4 对糖尿病脑缺血再灌注大鼠脑组织中MMP-9 表达的影响

目的:通过观察Exendin-4对糖尿病大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积百分比及脑组织中金属基质蛋白酶-9及基质金属蛋白酶抑制剂-1的变化,探讨Exendin-4对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用机制。方法:选用SD大鼠,给予链脲佐菌素(streptozocin,STZ)建立糖尿病大鼠模型后,随机分为A组:糖尿病对照组(n=6);B组:模型组(n=6);C组:Exendin-4低剂量组(n=6);D组:Exendin-4中剂量组(n=6);E组:Exendin-4高剂量组(n=6)。常规喂养6周后,A组给予假手术处理,B、C、D及E组采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血90 min再灌注模型,24 h后处死大鼠取脑组织,采用2,3,5一氯化三苯四唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色测算脑梗死体积百分比;同时分别采用Western Blot法及RT-PCR测量脑组织中的MMP-9及TIMP-1表达量。结果:脑缺血再灌注能致脑组织中MMP-9及TIMP-1表达量增高,各组与A组比较,有显著差异(P<0.05);给予Exendin-4处理后脑组织中MMP-9及TIMP-1表达增高程度及脑梗死体积百分比明显降低,与B组比较有显著差异(P<0.05)。结论:Exendin-4对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能与抑制MMP-9及TIMP-1的表达有关。     

利用BglBrick方法进行HSA/Exendin-4长效融合蛋白的快速组装

目的：通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白,为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法：选用酵母表达载体pPICZαA质粒,构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体,运用BglBrick方法,实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白,转入毕赤酵母菌KM71H中,用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果：用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论：利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。     

保守的第52位色氨酸突变引起的胰高血糖素样肽1受体N端片段活性丧失

通过易错PCR方法建立了一个鼠肺不同长度的nGLP-1R(从第21个氨基酸开始到第145个氨基酸)的噬菌体随机突变展示肽库,通过噬菌体表面展示技术检测胰高血糖素样肽1受体N端片段(nGLP-1R)在缺失一段或两段基因后是否还具有结合Exendin-4的活性.经ELISA分析发现了一株无结合活性的突变株,命名为EP16.经测序比对,发现EP16缺失了前20个和后10个氨基酸,且第52位色氨酸突变为精氨酸.为确定EP16与Exendin-4无结合活性的原因,重新构建了无前20个和后10个氨基酸的EP16野生型及第52位色氨酸变为精氨酸的全长nGLP-1Rw52R与EP16进行对比分析.结果表明,EP16的活性丧失是由保守的第52位色氨酸突变为精氨酸引起的,缺失的前20个和后10个氨基酸没有影响其生物学活性.关键位点单个氨基酸残基的突变可以改变胰高血糖素样肽1受体N端片段整个蛋白质的生物学活性.     

ADSCs联合Exendin-4治疗糖尿病大鼠创面愈合的机制研究

摘要 目的：探究ADSCs联合Exendin-4治疗糖尿病大鼠创面愈合的效果及可能机制。方法：通过高脂饲料喂养和腹腔注射链脲佐菌素（STZ,45 mg/kg）建立糖尿病SD大鼠模型。使用直径1 cm的皮肤打孔活检器在大鼠背部制作创面。将72只建模成功的大鼠随机分为糖尿病组、ADSCs组、Exendin-4组和ADSCs+Exendin-4组,每组18只。未建模的20只大鼠作为对照组。皮肤创伤后1天,按照指定给药方案进行给药,每天给药1次,共14天。检测治疗后大鼠的血糖、创面愈合率、微血管密度、创面组织学改变和血管生成因子（VEGF-A、VEGFR-2、PDGF-BB、PDGFR-β和HIF-1α）的蛋白表达水平。另外,将HUVEC细胞分为对照组、高糖组、ADSCs组、Exendin-4组和ADSCs+Exendin-4组,并对各组细胞进行相应的处理。检测了ADSCs和Exendin-4对缺氧和高糖培养的HUVEC的增殖、迁移和血管生成的影响。结果：ADSCs和/或Exendin-4治疗组大鼠的血糖水平与糖尿病组无显著差异（P>0.05）。与单独治疗组相比,ADSCs+Exendin-4组的创面愈合率、微血管密度和创面组织中VEGF-A、VEGFR-2、PDGF-BB、PDGFR-β和HIF-1α的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与单独治疗组的HUVEC相比,ADSCs+Exendin-4组的HUVEC的增殖、迁移和血管生成能力显著提高,并且血管生成因子的表达水平明显上调（P<0.05）。结论：对糖尿病大鼠创面组织局部施用ADSCs和Exendin-4可明显促进创面愈合。ADSCs和Exendin-4通过促进内皮细胞的增殖、迁移及血管生成因子的分泌来促进血管生成和创面愈合。     

GLP-1及其受体激动剂Exendin-4临床适应症的扩展

GLP-1及其受体激动剂Exendin-4是治疗糖尿病的一种理想药物,是近年来新的研究热点之一。近年发现,该类药物可从多个生理角度发挥功能,揭示其临床适应症可能有进一步的扩展空间。对GLP-1及Exendin-4的各种已知和潜在的临床适应症进行了概述,这些适应症除了各型糖尿病外,还包括肥胖症、神经系统和心脏的疾病以及其他各种潜在适应症。     

α-鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ相互作用研究进展

鹅膏毒肽是我国蘑菇中毒事件中致死率最高的蘑菇毒素。鹅膏毒肽引起机体中毒的主要机制为鹅膏毒肽与真核生物RNA聚合酶Ⅱ (RNAP Ⅱ)特异性结合并抑制mRNA形成。本文系统整理了有关α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的国内外研究进展。由于同一时代各领域对该主题有不同研究角度,研究进展既有平行也有交叉,因此,本文将鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的110多年研究史(1907-至今)分为8个阶段,包括(1) 鹅膏毒肽的早期研究、(2) 化学结构解析、(3) 毒理学研究、(4) 构-效关系研究、(5) 生物化学研究、(6) 分子生物学研究、(7) 结构生物学研究和(8) 药物开发与评价。本文按以上顺序,分主题论述α-鹅膏毒肽与真核生物RNAP Ⅱ相互作用的研究历程和重要研究结果,以期给中毒和临床毒理学等领域带来新的思考。     

两种树脂固相合成机体保护肽的比较

目的:比较Wang树脂和二氯三苯甲基树脂(以下简称二氯树脂)在固相合成机体保护肽中的表现,为工业化生产提供理论依据。方法:通用的Fmoc固相合成法制备机体保护肽,通过比色法对两种树脂与氨基酸的偶联率进行比较,用质谱(MALDI-TOFMS)对粗肽进行鉴定分析,用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行粗肽的分析和纯化。结果:显示以二氯树脂作载体,第一个氨基酸的连接率,以及机体保护肽的纯度和产率都要明显高于Wang树脂。结论:二氯树脂作载体合成机体保护肽更适合大规模工业化生产的要求。     

酶法制备海洋活性肽及其功能活性研究进展

海洋生物活性肽(Marine biological active peptide)是从海洋生物中提取的具有优化机体代谢环境、有益于机体健康的一类多肽。酶法制备海洋生物活性肽是目前最常用的制备方法,是通过适当的蛋白酶水解海洋生物蛋白来制备生物活性肽的一种方法。海洋生物活性肽在降血压、抗氧化、抗凝血及抗菌等方面效果显著,对治疗和预防疾病具有巨大潜力。介绍海洋生物活性肽在酶解制备及其生物学功能方面国内外研究进展,为进一步开展海洋活性多肽研究提供参考。     

食欲肽与肥胖抵抗

肥胖症是威胁现代人健康的重要疾病,它增加了糖尿病、高血压、高脂血症等疾病的发病率。肥胖的根本原因是机体能量摄入和消耗的失衡。食欲肽(orexin)是由下丘脑特异性分泌的一种能调节睡眠、摄食及能量平衡的神经肽。新近的研究表明,增加食欲肽水平和/或食欲肽的敏感性可通过提高机体自发活动(spontaneous physical activity,SPA)诱导的非运动生热作用(nonexercise activity thermogenesis,NEAT)而实现肥胖抵抗,进而开辟了一条治疗肥胖的新途径。该文综述了受食欲肽调控的SPA和NEAT与肥胖抵抗的关系,分析了食欲肽受体信号通路与肥胖的相关性,并阐释了食欲肽作为预防和治疗肥胖的分子靶标的作用机理。     

胶原蛋白肽对高脂日粮小鼠抗氧化能力和血脂代谢的影响

本文探讨胶原蛋白肽对高脂日粮小鼠抗氧化能力及血脂代谢的影响。40只小鼠随机分为5组(n=8):分别饲喂正常日粮,高脂日粮,添加0.5%和1%胶原蛋白肽及0.1%硫辛酸的高脂日粮。42 d后测定小鼠全血(血清)和组织活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、抗氧化酶活力及血脂水平。结果表明:0.5%和1%胶原蛋白肽都可显著降低机体ROS水平及MDA含量(P<0.05),增强抗氧化能力(P<0.05),改善血脂水平(P<0.05)。1%胶原蛋白肽能使机体抗氧化能力及血脂水平恢复到正常水平,0.5%的添加量效果不显著。适量的胶原蛋白肽可有效提高机体抗氧化能力,缓解高脂膳食造成的氧化应激,改善血脂代谢。     

高通量质谱法用于小鼠脑部神经肽的鉴定

神经肽在参与调控人体各种生理功能上发挥着重要的作用,如痛觉、睡眠、情绪、学习与记忆等生理活动都受到神经肽的影响。神经肽主要存在于机体的神经组织内,其他体液和器官中也有少量的分布。目前对全脑组织神经肽高通量鉴定的研究仍不足,高通量检测这些神经肽对了解神经肽的组成和功能具有重要的意义。本研究通过对小鼠全脑组织内源性肽段的萃取,运用液相串联质谱(LC-MS/MS)技术对全脑组织的神经肽进行检测,共鉴定到1 830条内源性肽段和99条预测神经肽肽段。这些内源性肽段的鉴定在疾病的治疗和机制研究以及药物的研发方面提供了参考价值,也为研究新的神经肽及其功能奠定了基础。     

蛙皮素可调节机体内环境恒定

蛙皮素可调节机体内环境恒定 14肽蛙皮素(bombesin)最初是从青蛙的皮肤中分离,晚近的研究发现,它也存在于哺乳动物的胃肠道和脑内。其后,又相继发现了C-末端10个氨基酸基本相同的27肽蛙皮素和约为32肽的蛙皮素。放射免疫测定表明,大鼠脑内蛙皮素含量最高的部位是下丘脑,这正是植物性神经最重要的整合中枢。大鼠侧脑室注射蛙皮素可引起体温明显改变,但该效应随动物所处环境温度的不同而异。环境温度为4～24℃时有明显降温作用。定位研究提示其作用部位似乎在下丘脑前部视前区。这种作用不是通过乙酰胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素、GABA等传递;但可被促甲状腺激素释放激素、生长抑素和纳络酮对抗。在低温环境中蛙皮素的降温作用主要与散热增加、促甲状腺激素分泌减少和耗氧量减少有关。     

激肽释放酶—激肽系统

新近的研究证明,激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kinin系统,简称K-K系统)是机体的一个重要的体液调节系统。它参与循环、血液凝固、水盐代谢、免疫活动以及许多器官的功能。特别是肾脏的激肽释放酶-激肽系统,构成与肾素-血管紧张素的平行系统。虽然早在20年代就知道了激肽的存在,但直到最近十多年来,这个系统才引起人们的广泛注意。随着研究的深入,愈来愈显示出激肽释放酶-激肽系统在生化、生理、病理、药理和临床上的重要性。激肽释放酶-激肽系统包含激肽释放酶和激肽两个基本成份,可区分为血浆激肽释放酶-激肽系统和     

Exendin-4通过JNK和ERK信号通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖

目的:探讨Exendin-4对大鼠脂肪来源干细胞的(Adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖作用及其机制。方法:体外分离培养SD大鼠腹股沟处脂肪组织,流式细胞学方法鉴定分离的ADSCs,使用Exendin-4(Ex-4,0-50 nm/L)对P4代(第四代)ADSCs进行干预,采用MTT检测ADSCs的增殖情况,Western blot检测MAPK通路中JNK和ERK的磷酸化水平,使用相应的阻断剂来观测JNK和ERK通路对ADSCs增殖作用的影响。结果:分离培养的ADSCs高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD31、CD34和CD45,符合间充质干细胞的表型。Ex-4以浓度依赖方式促进ADSCs体外增殖,10 nm/L为最适促增殖处理浓度。同时,Ex-4可以提高细胞中c-Jun和ERK的磷酸化水平,而给予相应阻断剂后,磷酸化蛋白表达减弱,细胞增殖能力也明显减弱。结论:Ex-4可以通过JNK和ERK通路增强大鼠脂肪来源干细胞的增殖。     

细胞因子作为DNA疫苗佐剂的研究进展

细胞因子是机体细胞(主要指免疫细胞)产生的一类具有广泛生物学活性的异质性肽类调节因子,在体内能激活免疫活性细胞,对免疫应答的产生和调节有重要作用。近年来,大量研究表明细胞因子可作为DNA疫苗佐剂来增强疫苗的免疫效果。简要综述了细胞因子作为DNA疫苗免疫佐剂的研究进展。