日本育成葡糖淀粉酶重组酵母菌

1986年在大阪召开的大阪发酵工程学年会上,三得利啤酒公司应用微生物研究所和酒类研究所发表了一项研究成果。用DNA组入染色体的方法选育成功稳定的基因重组酵母菌。将根霉的葡糖淀粉酶基因组入乙醇发酵能力接近于生产菌的酵母菌中,使其分泌产生葡糖淀粉酶,而无需加热处理(无蒸煮)就能由淀粉产生13％以上的乙醇。特别在用木薯淀粉为原料时分解率很高。转化为乙醇的产率与现行工业生产法相同。为使染色体中重组性能稳定,从小瓶到大容器重组体经数十代仍可稳定产生葡糖淀粉酶。 此重组体有可能在良好的通用发酵罐中实现工业化。该公司已实现用根霉的葡糖淀粉酶进行淀粉的无蒸煮乙醇生产,这种方法由淀粉产乙醇的能耗量约减少了三成。     

中温α-淀粉酶在地衣芽孢杆菌中的异源表达

提高中温α-淀粉酶生产菌株的发酵温度,对减少冷却水消耗降低生产成本有重要意义。本文利用基因删除技术删除了地衣芽孢杆菌CBBD302菌株α-淀粉酶的编码基因(amy L)获得突变株D402。将表达解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶基因Ba A的重组质粒p HY-WZX-Ba A转化D402,获得表达中温α-淀粉酶的重组地衣芽孢杆菌D402/p HY-WZX-Ba A。摇瓶发酵实验显示,重组菌最适发酵温度为42℃,比原生产菌株提高8℃,最高产酶水平达到301 U/m L。30 L发酵罐发酵试验,78 h达到最高酶活531 U/m L。重组酶的最适作用温度为60℃,最适作用p H 6.5,在90℃保温20 min可以完全失活,保持了中温α-淀粉酶既能在淀粉糊化温度下保持稳定又便于灭酶的优良性能。     

真菌对rDNA产物越来越有用

利用一种表达系统已在一些丝状真菌中产生出一种组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)和其它一些重组体蛋白,这种表达系统是由 ZymoGenetics 公司的 Alan Upshall参加的,由工业微生物学会于8月10～15月在旧金山(加利福尼亚)召开的一次年会上叙述的。ZymoGenetics 公司(因研究重组体酵母而十分有名)不是注视重组体丝状真菌的一家唯一公司。Genencor 公司(南旧金山,加利福尼亚)以及或许还有其它一些公司正在注视这些微生物(在工业规模上将长期用来生产传统发酵产品)以生产重组体蛋白。     

紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株

以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株,以这些菌株产蛋白酶(酸、中、碱)、淀粉酶(α-淀粉酶、糖化酶)活力大小为评价标准,筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株。采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造,最终筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。将米曲霉Y29菌株应用于黄豆酱的生产中,并与目前工业生产中广泛应用的米曲霉沪酿3.042菌株进行比较。性能实验结果表明米曲霉Y29菌株的蛋白酶(酸、中、碱)活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株,但α-淀粉酶、糖化酶、生长速度和孢子数这4个指标两者的差异并不显著;制酱品质试验结果表明,米曲霉Y29菌株的酱香更浓郁一些,氨基酸态氮含量达到0.77g/100mL,高于米曲霉沪酿3.042菌株,其它指标均符合国家标准GB2718-1996。     

葡糖淀粉酶基因的分子生物学研究

从酶活、底物、产物、应用及空间结构等方面论述了葡糖淀粉酶的一般生物学特性及应用,分析了其不同来源的基因同源度。着重从分子生物学角度阐述了葡糖淀粉酶基因在多种表达系统中的分泌表达情况,并对其基因在曲霉及酵母中的高效表达及分泌引导功能进行了初步阐述和探讨。     

透明颤菌血红蛋白在产聚γ-谷氨酸地衣芽胞杆菌WX-02中的表达

聚γ-谷氨酸(γ-PGA)是一种应用前景良好的生物高分子材料.通过构建含有α-淀粉酶(amyE)基因两端交换臂的整合载体pDG1730-vgb,将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到聚γ-谷氨酸生产菌株地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02染色体中,获得重组子M2.一氧化碳差光光谱结果验证M2中表达了有活性的血红蛋白,3 L发酵罐分批发酵结果显示M2的生物量比出发菌株WX-02提高了25.5%,γ-PGA产量提高了20%.     

一种具有琼胶酶活性的海洋细菌淀粉酶的表达和分析

旨在验证海洋新种细菌ZC1中可能存在的具有琼胶酶活性的淀粉酶。对菌株ZC1中的淀粉酶编码基因amy440进行基因克隆和重组原核表达,并用活性电泳法验证重组蛋白的淀粉酶和琼胶酶活性。结果显示,基因amy440的重组蛋白在淀粉酶和琼胶酶活性电泳上均出现活性显色条带。菌株ZC1中基因amy440的编码蛋白是一种具有琼胶酶活性的淀粉酶。     

通过同源介导a-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌a-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一。为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL。将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株BacilluslicheniformisB0204,再在卡那霉素存在下介导其B.licheniformisB0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子。对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定。与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高。其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。Β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

利用木薯淀粉产异丁醇的重组菌株的构建

目的:构建了一株直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇的重组菌株。方法:将地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因克隆到生产异丁醇的大肠杆菌重组菌中,使大肠杆菌能够直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇。结果:木薯淀粉不需要预先加入淀粉酶进行糖化处理,就可以直接被作者研究所构建的重组菌株发酵生成异丁醇。结论:提供了一种直接发酵木薯淀粉生产异丁醇的方法。导入地衣芽孢杆菌的淀粉酶基因,能使只能利用葡萄糖作为发酵材料的异丁醇生产工程菌直接利用木薯淀粉为原料生产异丁醇。     

通过同源介导α-淀粉酶基因扩增改良地衣芽孢杆菌α-淀粉酶生产菌株

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(BLA)是淀粉水解与生物加工过程中重要关键酶制剂之一.为了进一步提高地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶生产菌株的生产性能,本研究构建了一种含有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶编码基因amyL的整合性重组质粒pBL-amyL.将重组质粒pBL-amyL转化入BLA工业生产菌株Bacillus licheniformis B0204,再在卡那霉素存在下介导其B.1icheniformis B0204染色体中的同源整合与高温α-淀粉酶编码基因amyL的扩增,由此获得了携带多个amyL拷贝的转化子.对转化子的amyL拷贝数及其BLA发酵水平分别用荧光实时定量PCR及摇瓶发酵试验进行评价与鉴定.与出发菌株B0204相比,含2～5倍amyL拷贝数的重组菌的BLA的合成水平显著提高.其中,重组菌REBL18生产BLA的水平提高了89.2%.     

米曲霉基因工程技术的进展

丝状真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)是发酵工业的重要菌株,具有强大的蛋白分泌能力和公认的食品安全性,可作为表达外源蛋白的细胞工厂。然而利用米曲霉分泌生产外源蛋白质常会受限于一些瓶颈问题:包括转录、翻译、蛋白质折叠、易位、降解、运输和分泌等。这些问题的存在导致米曲霉外源蛋白生产很难达到预期的效果。近年来,随着全基因组序列的破译,米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术都得到了较好的发展。如提高同源重组效率、选择性标记基因应用技术、染色体大片段删除技术、菌丝融合技术和DNA芯片技术等。这些技术的开发和建立为米曲霉工业生产应用提供了大量技术支持。针对米曲霉在外源表达蛋白中存在的瓶颈问题,主要通过以下几个方面进行了阐述:转化系统的优化和转化效率的提高、蛋白酶基因缺陷菌株的构建、融合表达策略,以及优化其外源表达系统来提高外源蛋白生产等。这些米曲霉生产相关基础研究以及基因工程技术的进步很大程度上提高了米曲霉的生产应用,并为今后米曲霉生产菌株的育种提供了更多有效的途径和研究空间。     

曲霉淀粉酶基因与转录调控研究进展*

本文总结了到目前为止已克隆到的曲霉淀粉酶基因,并阐述了已发现的与调控相关的元件和因子如：顺式作用正调控元件和反式作用正调控因子等,在此基础上提出了曲霉淀粉酶基因的转录调控方式,并简述了曲霉淀粉酶基因的应用前景。 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称,广泛存在于动植物和微生物中（张树政 1984）。由于淀粉酶在工农业上的重要价值,因此很早就有人对淀粉酶进行研究。我国50年代初,先后研究和生产米曲霉的α-淀粉酶用作消化剂和葡萄糖生产,将细菌产生的α-淀粉酶用于纺织品退浆、饴糖制造等(张树政 1984);随着分子生物学技…     

新的表达克隆法

世界最大的产业用酶厂家丹麦Novo Nordisk公司表示正在实用化不必纯化酶、但克隆酶的基因,以曲霉为宿主大量生产酶的新系统。该系统是首先使用大肠杆菌构建编码酶的、真菌的DNA文库。接着在酵母中导入文库基因,获得在平皿上检测酶活性的菌株,再将基因移到曲霉Aspergillus上,大量生产具有目的活性的酶。Novo公司正在配备用该系统大量生产的酶是“Monocomponent enzyme(单一成分酶)”。Novo公司确立以洗涤剂用脂酶为开湍事业化的新系统可以说是很有优势的。 Novo公司11月销售的纤维加工用重组纤维素酶制剂也是用该系统开发的产品。据说这种单一成分酶可高效率地分解非结晶区域的纤维素的结合,但强度不会降低且有效地防止起绒毛。     

曲霉属种间原生质体融合后病毒传递及遗传重组——Ⅱ.黑曲霉与米曲霉种间杂交

感染直径28-33纳米球形病毒的葡糖淀粉酶生产菌黑曲霉与无病毒生长较快的米曲霉通过原生质体融合杂交,获得两种形态不同的种间杂种。杂种Ⅰ经遗传及生化分析推测是二倍体,杂种Ⅱ不产孢子并生长较慢。两个杂种均感染了病毒,病毒形态、血清反应、衣壳多肽及核酸组份均与亲本黑曲霉的病毒相同。杂种诱发分离的后代中,多数包括亲代型黑曲霉分离子及其它分离子均感染了病毒,只有一个分离子和来自异核体的一个分离物例外,二者均产生亲代型米曲霉类型的孢子。这种亲代型分离表明病毒种间传递并非胞质遗传。 黑曲霉与米曲霉分属黑曲霉群及黄曲霉群,是曲霉属内亲缘关系远的种间杂交,迄今并无报道。杂种Ⅰ具有接近原始亲本的葡糖淀粉酶的产量及米曲毒的生长速度。     

大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L-phe生产的影响

L-phe是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影响,在大肠杆菌PTS系统中,葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得。利用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除,得到PTS缺陷菌株MD-ptsG-。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe产量提高12%。     

Knockout of ptsG Gene in Escherichia coli and Its Influence on Production of L-phenylalanine

L-phe 是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成 phe 时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对 phe 产量合成有很大影响,在大肠杆菌 PTS 系统中,葡糖糖主要由 ptsG 基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得.利用 Red 同源重组技术将大肠杆菌染色体上的 ptsG 基因进行敲除,得到 PTS 缺陷菌株 MD-ptsG-.该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe 产量提高12％.     

Novo公司在美国开始生产重组酶

丹麦Novo Nordisk公司继日欧之后,也在美国开始利用重组微生物生产酶.Novo Nordisk公司的美国法人Novo Nordisk Biochem公司整顿了重组酶的生产体制. Novo公司最初在美国生产的重组酶是用于淀粉工业和纤维工业的耐热性α-淀粉酶.用生产菌芽孢杆菌属菌株的基因重组提高了产物的产率. 该公司去年10月就重组菌用于工业生产这一专题邀请了工厂所在社区的居民和立法、行政当局召开了约60人的说明会.     

热稳定α—淀粉酶稳定性工程菌的构建

本文以质粒pE194为载体亚克隆B.licheniformis热稳定α-淀粉酶基因,构建成重组质粒pNW102,通过噬菌体PBS1将它转导进入中温α-淀粉酶生产菌B.subtilis BF7658。B.subtilis BF7658(pNW102)经过长时间非许可温度处理,筛选得到2株热稳定α-淀粉酶稳定性表达的工程菌株。酶学分析显示同源重组具有热点,2株重组菌株B.subtilis BFNW产生的热稳定α-淀粉酶符合B.licheniformis产生的淀粉酶特性。