1株枯草芽胞杆菌的鉴定及其弹性蛋白酶结构研究

鉴定弹性蛋白酶产生菌株EL32,确定该酶的基本结构。采用分子生物学、形态学及生理生化性质对菌株EL32进行鉴定;用硫酸铵沉淀、离子交换层析和分子筛层析纯化酶蛋白;借助肽指纹图谱及酶基因克隆技术研究该酶的一级结构;利用同源建模的方法研究该酶的空间结构。菌株EL32的16S rDNA与枯草芽胞杆菌16S rDNA的同源性达到99%,其菌落呈乳白色,其细胞革兰染色阳性,具有芽胞;发酵葡萄糖试验产酸不产气,明胶水解试验呈阳性,能够水解淀粉,V-P反应呈阳性,鉴定为枯草芽胞杆菌。从菌株BL32发酵液中纯化得到了弹性蛋白酶,SDS-PAGE分析显示其分子量为31 ku。用LTQ-MS测定肽指纹图谱表明该弹性蛋白酶是枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin,该酶的基因和蛋白质序列与枯草芽胞杆菌蛋白酶subtilisin的同源性都高达99%。菌株EL32弹性蛋白酶的三维结构含有6个α-螺旋,7个扭曲的平行β-折叠以及2个反平行的β-折叠,His、Asp和Ser是其活性中心的关键基团。鉴定了1株产弹性蛋白酶的枯草芽胞杆菌,确定了其弹性蛋白酶是蛋白酶subtilisin,为该枯草芽胞杆菌蛋白酶的应用提供了基础。     

地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因克隆与表达特性

目的建立高产量和高活力的地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶基因表达体系。方法采用PCR技术克隆获得目的基因,将其连入表达质粒pET-32 a构建原核表达重组质粒,经测序鉴定后,转化BL21大肠埃希菌,不同温度下IPTG诱导表达融合蛋白,测定酶活;进一步对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果碱性蛋白酶基因序列全长1 149 bp,编码382个氨基酸,同源性为99%,融合蛋白分子质量为62 kD,蛋白酶酶活为29 000 U/mL,并且在25℃时是以可溶蛋白形式表达,37℃时部分蛋白以包涵体形式存在。结论此种表达体系可以成功表达具有生物活性的碱性蛋白酶,诱导温度对蛋白酶存在形式具有较大影响。     

炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建

为制备炭疽芽胞杆菌的基因芯片探针文库,以炭疽芽胞杆菌毒素质粒pX01和荚膜质粒pX02为原材料,用Sau3A I酶切pX01和pX02质粒DNA,Taq DNA聚合酶72℃补平加A,经AT克隆,PCR初步鉴定筛选出炭疽质粒片段的阳性克隆．DNA自动分析仪对克隆片段进行序列测定;用生物信息学方法对其片段进行同源性分析;并将克隆的探针打印于玻片上,制备成炭疽芽胞杆茵基因芯片,与炭疽杆茵质粒DNA样品进行初步芯片杂交的实验,杂交实验的阳性率达到了90％以上,证明大部分克隆探针属于炭疽芽胞杆菌．炭疽芽胞杆菌基因芯片探针文库的构建为基因芯片探针的制备摸索出一条简便、高效、可行的方法．     

植物根际芽胞杆菌菌种资源采集及其具有过水解催化活性水解酶基因的克隆

[背景]芽胞杆菌源枯草杆菌蛋白酶(subtilisin carlsberg)、乙酰基木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)和头孢菌素乙酰水解酶(cephalosporin acetyl hydrolase)具有较高的过水解催化活性,有商业开发价值。[目的]挖掘芽胞杆菌菌株中具有过水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,为后续制备过水解酶及酶法合成过氧乙酸奠定基础。[方法]利用定向筛选培养基,从植物根际及纳豆产品中筛选产蛋白酶芽胞杆菌候选菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因对其进行鉴定。从蛋白酶高产芽胞杆菌菌株中克隆枯草杆菌蛋白酶、乙酰木聚糖醋酶和头孢菌素乙酰水解酶的全长基因。[结果]从植物根际土壤及纳豆产品中共分离到85个候选菌株,RFLP及16S rRNA基因鉴定结果表明候选菌株均为芽胞杆菌,分别属于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四个类群。从B.subtilis NSYT-3克隆的枯草杆菌蛋白酶基因编码的多肽链全长381个氨基酸,从B.pumilus OSLJ-3克隆得到的乙酰基木聚糖酯酶基因编码的多肽链全长320个氨基酸,从B.subtilis NSYT-3克隆的头孢菌素乙酰水解酶基因编码的多肽链全长318个氨基酸,3D结构模拟表明这3个酶蛋白均具有α/β水解酶折叠家族蛋白结构特点。[结论]芽胞杆菌源具过水解催化活性水解酶基因的克隆,为后续开发酶法合成过氧乙酸工艺奠定了基础。     

肽聚糖水解酶基因缺失对解淀粉芽胞杆菌活菌数量及产碱性蛋白酶的影响

为了探究肽聚糖水解酶对解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)活细胞数量以及碱性蛋白酶产量的影响,对解淀粉芽胞杆菌TCCC111018中的5个肽聚糖水解酶基因(lytC、lytD、lytE、lytF、lytG)分别进行敲除.通过分析对比基因缺失前后的生物量以及碱性蛋白酶酶活力发现,敲除菌株...     

解淀粉芽胞杆菌启动基因的克隆及其对地衣杆菌α-淀粉酶基因的调控

用大肠杆菌启动基因探针质粒pHE5克隆了解淀粉芽胞杆菌的启动基因。供体菌DNA的HindⅢ片段与pHE5重组后转化大肠杆菌,获得一批带启动基因的抗四环素转化子,其中四株的抗性达到200μg/mL,从这四株高抗性转化子中提取质粒,并对其中的一个重组质粒pAE23的插入片段进行限制性图谱分析和缺失研究,获得了一个缺失了部份片段,四环素抗性仍达到200μg/mL的衍生质粒pAED23,经酶切分析证明其上的启动基因位于0.8kb的EcoR Ⅰ—HindⅢ片段上。点杂交分析证实该片段来自解淀粉芽胞杆菌的DNA。将地衣杆菌的α-淀粉酶基因亚克隆至pAED23启动基因下游的HindⅢ位点上能增强该基因在大肠杆菌中的表达。     

静态强磁场对枯草芽胞杆菌的影响研究

目的:研究静态强磁场下微生物的生物学效应.方法:以超导磁体产生的静态强磁场为基础,枯草芽孢杆菌为模式生物,通过测定生长曲线、芽胞生成率、蛋白酶表达量、蛋白酶活力等研究静态强磁场条件下微生物性状的变化.结果:强磁场可以影响枯草芽胞杆菌的芽胞形成速率,抑制营养体的死亡;测定菌体生长过程中蛋白酶的含量以及碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力,发现磁场处理前后蛋白酶的含量没有发生显著性变化,处理组碱性蛋白酶的酶活力明显高于对照组,而中性蛋白酶酶活力则低于对照组.结论:强磁场可以延长枯草芽孢杆菌的世代周期,降低菌体死亡率,对细菌酶活性的影响因酶的种类不同而异.     

假坚强芽胞杆菌中乙醇降解相关酶的克隆、表达及酶学特性

【目的】研究假坚强芽胞杆菌OF4中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶学特性。【方法】通过引物设计,采用PCR技术从嗜碱芽胞杆菌OF4的基因组DNA中扩增获得乙醇脱氢酶(adh)基因和乙醛脱氢酶(aldh)基因,构建表达载体,通过异源原核表达,Ni-NTA柱层析纯化酶蛋白,分析其酶学特性。【结果】乙醛脱氢酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,酶蛋白的活力为979.6 U/mg,其稳定性在25℃和35℃下比45℃稍好;尽管由于乙醇脱氢酶的表达量低而未能纯化获得酶蛋白,但通过双基因共表达及乙醇耐受性实验发现乙醇脱氢酶也具备较高的催化活性。【结论】成功地从假坚强芽胞杆菌OF4中克隆获得了乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶基因,二者共同作用能够较大提高宿主对乙醇的耐受性。     

制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的初步研究

建立制备炭疽芽胞杆菌检测基因芯片的技术,并探讨研制检测炭疽芽胞杆菌基因芯片的方法。酶切炭疽芽胞杆菌的毒素质粒和荚膜质粒,通过建立质粒DNA文库的方法获取探针,并打印在经过氨基化修饰的玻片上,制成用于炭疽芽胞杆菌检测的基因芯片。收集了290个阳性克隆探针,制备了检测炭疽芽胞杆菌的基因芯片。提取炭疽芽胞杆菌质粒DNA与基因芯片杂交,经ScanArray Lite芯片阅读仪扫描得到初步的杂交荧光图像。通过分析探针的杂交信号初步筛选出273个基因片段作为芯片下一步研究的探针。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌被鉴定为苏云金芽胞杆菌,鞭毛血清型H2,幕虫亚种;产生卵圆形伴胞晶体,伴胞晶体蛋白为100kD;测定了该蛋白 N－末端序列,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S－层蛋白具92－93％相似性,根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱,分别克隆了该基因5’和3’端所在2．9kb XbaI片段和3．1kb Cla I DNA片段,彼此间具0．6kb重叠,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆,含该基因的大肠杆菌与表达S－层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征,初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S－层蛋白组成,苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体,由于S－层是细胞表面的结构成分,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑。     

蜡状芽胞杆菌转录激活子PIcR调控多基因的表达

蜡状芽胞杆菌是一种条件致病菌 ,它能引起食物中毒和其它形式的疾病。潜在的致病因子包括磷脂酶C、溶血素、肠毒素和呕吐毒素等。在很多致病菌中致病因子的表达都是协同调控的。从蜡状芽胞杆菌模式菌株ATCC1 4579经转座子诱变的文库 ,筛选到一株磷脂酶阴性的突变子 ,该突变子的蛋白酶活性明显减弱了。插入位点的序列分析表明 ,一个高度同源于苏云金芽胞杆菌转录激活子PlcR的基因被插入失活了。研究结果表明 ,除在苏云金芽胞杆菌中能激活磷脂酰肌醇磷脂酶C基因的转录外 ,转录激活子PlcR至少还能调控卵磷脂酶和一个或多个蛋白酶基因的表达 ,这是一个多效调节因子。     

蜡状芽胞杆菌转录激活子PlcR调控多基因的表达

蜡状芽胞杆菌是一种条件致病菌,它能引起食物中毒和其它形式的疾病。潜在的致病因子包括磷脂酶C、溶血、肠毒素和呕吐毒素等。在很多致病菌中致病因子的表达都是协同调控的。从蜡状芽胞杆菌模式菌株ATCC14579经转座子诱变的文库,筛选一株磷脂酶阳性的突变子,该突变子的蛋白酶活性明显减弱了。插入位点的序列分析表明,一个高度同源于苏云金芽胞杆菌转录激活PlcR的基因被插入失活了。研究结果表明,除在苏云金芽胞杆菌中能激活磷脂酰肌醇磷脂酶C基因的转录外,转录激活子PlcR至少还能调控卵磷脂酶和一个或多个蛋白酶基因的表达,这是一个多效调节因子。     

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示研究进展

枯草芽胞杆菌芽胞表面展示技术是把枯草芽胞杆菌作为芽胞表面展示的宿主来展示目的蛋白的一种技术。该技术不仅具备芽胞表面展示技术可展示分子量较大的目的蛋白、目的蛋白无需跨膜及芽胞的极强抗逆性等特点外,同时由于该技术的宿主菌--枯草芽胞杆菌的分子生物学信息研究得比较清楚、安全性高而被广泛应用。介绍了枯草芽胞杆菌表面展示近10年在生产疫苗和固定化酶方面的进展,并对如何提高表面展示目的蛋白的产量做了简要概述。     

产酶芽胞杆菌的筛选及菌株HB13000的鉴定

芽胞杆菌产酶种类多、生长速度快、抗逆性强,在堆肥过程中发挥着重要作用。本研究采用水解圈法研究了348株芽胞杆菌产酶特性,获得产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶芽胞杆菌34株。其中,菌株HB13000相对酶活力较高,酶活Hc(水解圈直径/菌落直径)分别为:纤维素酶Hc=4.30,蛋白酶Hc=1.47,淀粉酶Hc=3.25,对纤维素、淀粉和蛋白质均表现出较强的降解活性。依据菌体形态、生理生化特征和16S r DNA系统发育分析,鉴定HB13000为Bacillus methylotrophicus(甲基营养型芽胞杆菌)。本研究为有机物降解与农业废弃物堆肥提供了新的菌种资源。     

鸡源益生芽胞杆菌的筛选

根据菌体对低pH和高胆盐的耐受性、产酶特性和对病原菌的抑菌效果,对家鸡肠道中的芽胞杆菌进行了筛选。结果表明,有4株芽胞杆菌(A2、C5、C19和D8)能抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的生长。这4株菌在pH 3.0和高胆盐条件下的存活率都达到60%以上,产淀粉酶和蛋白酶的能力也较好,表明这些菌株具有作为益生菌的开发潜力。经形态学和生理生化反应鉴定,初步确定A2和D8为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniform is),C5和C19为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)。     

碱性土壤微生物基因的克隆和多样性分析

从碱性土壤样品中直接抽提和分离宏基因组DNA, 首先构建了包含5 562个阳性克隆的碱性土壤16S rDNA文库, 随机抽取9个克隆测序后构建的系统进化树表明了碱性土壤环境微生物种群基因的多样性。纯化土壤宏基因组DNA后采用EcoRⅠ酶部分酶切处理, 我们又构建了以pGEM-3Zf(+)为载体的DNA部分文库AL01。AL01文库包含23650个克隆, 随机插入载体的外源DNA片段平均大小为3.2 kb左右, DNA文库的总容量为75.68 Mb。建库效率为从每克环境样品中获得6 000个左右的含随机外源DNA片段插入载体的克隆。采用酶活筛选策略, 我们从AL01文库中筛选到一个编号为pGXAA2011的阳性克隆携带有一个完整的碱性蛋白酶基因。蛋白酶活性检测其酶活作用最佳温度为40℃, 最适作用pH 值为9.5。另外, 我们还克隆和表达了一个新型b-葡萄糖苷酶基因unglu01, 该基因和现有数据库中的b-葡萄糖苷酶基因没有任何DNA或者氨基酸水平的同源性。将unglu01基因的ORF与表达载体pETBlue-2连接后导入宿主菌株Tuner(DE3)pLacI中, 该重组表达克隆在含柠檬酸高铁铵和七叶苷的LA平板上表现清晰的b-葡萄糖苷酶活性, SDS-PAGE电泳可以检测到29 kDa大小的目的蛋白。     

类似S-层蛋白的苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白基因的克隆

芽胞杆菌CTC菌株被鉴定为苏云金芽胞杆菌 ,鞭毛血清型H2 ,幕虫亚种 ;产生卵圆形伴胞晶体 ,伴胞晶体蛋白为 1 0 0kD ;测定了该蛋白的N 末端序列 ,该序列与炭疽芽胞杆菌的细胞表面S 层蛋白具 92 %～ 93%相似性 ;根据Southern杂交制作了该晶体蛋白基因ctc所在位置的限制性酶切图谱 ,分别克隆了该基因 5′和 3′端所在的 2 9kbXbaI片段和 3 1kbClaIDNA片段 ,彼此间具 0 6kb重叠 ,通过拼接获得含完整ctc基因的克隆。含该基因的大肠杆菌与表达S 层蛋白的大肠杆菌具相似生长特征。初步表明CTC菌株的伴胞晶体由细胞表面S 层蛋白组成。苏云金芽胞杆菌区别于蜡状芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌的唯一标准是能形成伴胞晶体 ,由于S 层是细胞表面的结构成分 ,本文对CTC菌株鉴定为苏云金芽胞杆菌以及伴胞晶体作为苏云金芽胞杆菌鉴别的唯一标准提出了质疑     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析

哈维氏弧菌是引起大黄鱼疾病的主要致病菌之一,胞外蛋白酶是哈维氏弧菌GYC1108-1的主要致病因子。利用表型克隆技术,用Sau3AⅠ将提取的哈维氏弧菌基因组DNA酶切成短片段,纯化回收1-5 kb的片段与BamH I酶切的pUC118在T4连接酶的作用下进行连接,并转化感受态细胞TG1,在含0.5%脱脂奶和100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上筛选胞外蛋白酶阳性株,命名为YZ。测定阳性株YZ的胞外蛋白酶活性,并对阳性株的重组质粒的插入片段进行序列测定,分析开放阅读框,确定胞外蛋白酶基因编码区。发现蛋白酶基因的ORF编码531个氨基酸,在起始密码子ATG上游存在一个核糖体结合位点(SD),其上游的启动区与大肠杆菌的σ70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同源。在终止子(TAG)下游,存在两个反向重复序列,为推导的2个转录终止子。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆与诠释为哈维氏弧菌致病机理和疫苗的开发奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16D2株BA2380基因缺失突变株的构建

本课题组早期研究结果表明,炭疽芽胞杆菌BA2380蛋白可能与炭疽芽胞杆菌毒力有关,因而有必要对其功能进行深入研究。选取炭疽芽胞杆菌A16D2株为出发菌株,以其BA2380基因为目的缺失基因,参照A16D2株基因组序列及质粒pSET4s序列,利用软件设计上下游同源臂及抗性基因引物,用本实验室改造的“Golden Gate”克隆方法将3个片段同时连入温敏型穿梭载体pKMBK中(本实验室构建的受体质粒),从而构建基因打靶质粒。将该基因打靶质粒导入炭疽芽胞杆菌A16D2感受态细胞中,利用同源重组原理,筛选获得炭疽芽胞杆菌A16D2 BA2380基因缺失突变株,并对其进行验证。结果验证了本课题组构建的“Golden Gate”克隆体系进行多片段克隆的高效性,也为后续探索其基因功能奠定了基础。