RNA 3`-末端P标记及其核普酸简易测定

近几年来，遗传的物质基础，即脱氧核糖核 酸(DNA）序列分析技术，有了重大突破^[5,7] 对核酸的结构与功能、基因表达、调控等研究起 了巨大的推动作用。核糖核酸（RNA）序列分 析工作，在经典方法的基础上，借鉴于DNA序 列分析方法，也得到了迅速的发展^[2,6]。简易直 读技术也广泛应用于RNA序列研究中。DNA 或RNA序列分析，多采用体外放射性同位素 标记示踪法，其中用放射性磷[³²P l标记核酸 的5‘一或3’一末端，是研究核酸结构必不可少的 手段。     

DNA序列分析技术的发展

测定DNA的核苷酸序列,对于了解基因及其产物的结构、基因表达、及其表达的调控机制,乃至对于基因改造和分子进化研究等方面,均具有重要的意义。本文将就DNA序列分析技术的产生、应用和发展作一简单综述。一、DNA序列间接测定技术在分子生物学研究的早期,DNA序列信息只能由获得的氨基酸序列或RNA序列推测而来。在Waston和Crick的DNA双螺旋模型建立(1953年)不久,Sanger发明了氨基酸序列测     

实现“终极版”核苷酸测序仪的技术要素

20世纪70年代发明的第一代DNA测序技术,尽管测序通量有限,却成功地保证了“人类基因组计划”的实施;世纪之交出现的下一代(第二代) DNA测序技术经历了通量飞跃,为各种精准医学项目的实施提供了保障;目前的第三代技术,尽管通量居二代之后,但读长和单分子测序优势也让其有立足之本;第四代测序技术的基本标志是不经过cDNA (以RNA为模版合成的互补DNA),无PCR扩增,而直接测定单分子RNA序列,以及确定单分子RNA上的修饰核苷酸位点。从技术的角度看,第三、四代技术有一定技术要素共享(比如在单分子水平测定DNA序列),但是就测序对象而言,第四代应该属于“终极版”核苷酸测序仪：可以从单细胞出发,既能测定DNA序列,也可以测定RNA序列,也可以直接确定修饰核苷酸位点。因此,要实现这个“终极版”核苷酸测序仪,就要调动相关核心技术要素,而这些要素毫无疑问地会涉及物理、化学、工程学、生物学、半导体科学、计算机科学等领域的前沿技术,包括纳米科学、单分子光学、单分子拉曼光谱、单分子核磁共振、单分子酶学、人工智能等所谓的“硬科技”。其功能是从单细胞的裂解开始,经微纳结构实现组分分流后,直接导入RNA序列测定单元,定量分析细胞RNA分子的种类、数量、序列和修饰核苷酸位点的存在频率。本文系统介绍了第四代测序仪的可能技术要素,以及应用需求和新研究范式。     

RNA序列分析新方法

自从Maxam,Gilbert和Sanger分别建立了化学法及“加”、“减”法等DNA序列分析技术之后,使核酸结构与功能方面的研究取得了重大的进展,同时,也推动了RNA序列分析新技术的发展。开始,是结合凝胶电泳技术,利用一系列碱基专一性核糖核酸酶分别部分降解RNA,而建立了所谓酶法直读技术。后来,又创造了RNA的化学修饰以及化学修饰与酶相结合的直读技术。这些新技术的发展,使人们得以     

RNA编辑修复藻苔(Takakia lepidozioides)叶绿体accD基因中的突变

藻苔(Takakia lepidozioides)叶绿体基因组中存在着非常高的RNA编辑频率,这种现象至今没有得到很好的解释。本研究采用比较基因组学方法,对小立碗藓(Physcomitrella patens)、青苔(Syntrichia ruralis)和藻苔3种苔藓植物中accD基因的DNA序列和基因编码的蛋白氨基酸序列进行比较分析。研究发现,经过RNA编辑,藻苔的基因产物获得了与其同源基因相同的氨基酸序列。藻苔中高频发生的RNA编辑是对基因组中DNA突变的一种修复,提高了藻苔对强辐射环境的生存适应能力。     

中心法则导论（五）

二、RNA中的遗传信息并不一定来自DNA(RNA编辑的发现)。 根据中心法则,mRNA的序列与其DNA模板的序列是严格的——对应的,这种所谓     

虫生真菌的分子生物学检测技术

线粒体DNA探针、核糖体RNA编码DNA序列分析、随机扩增多态性DNA－聚合酶链式反应、基因组DNA探针和电泳核的,五类分子生物学技术在虫生真菌研究中已有应用。本对此作了介绍,着重阐述了RAPD－PCR技术的特点及其使用此技术的研究成果。     

核小体定位与RNA剪接

根据核小体定位序列和缺失序列的碱基分布特征,应用多样性增量二次判别方法(IDQD)构建模型对这两类序列进行了区分,受试者操作特性曲线下的面积达到了0.958．应用这一模型研究了核小体在人类基因组剪接位点(GT/AG)邻近序列中的分布方式,发现外显子所对应的DNA序列通常倾向参与核小体的形成,并且由它所转录的RNA统计上具有较强的刚性,而剪接位点及其邻近的内含子对应的DNA序列则避免参与核小体的形成,所转录的RNA统计上具有较强的柔性．进一步还发现,DNA序列的核小体定位/缺失和RNA的刚性/柔性具有统计相关性,为从机制上解释为何前体RNA剪接事件与DNA序列中的核小体定位信息有关提供了依据．     

DNA序列分析技术的进展

近几年来,DNA序列分析技术有了很大发展,可以说,分子生物学突飞猛进的发展与DNA序列分析技术的不断改善是分不开的。虽然Wat(?)on与Crick早在1953年就测出了DNA的双螺旋结构,然而直到六十年代末还没有人能对DNA进行序列分析。值得注意的是,人们在六十年代中期就能够进行RNA序列分析。第一个被测出完整     

人X染色体长臂(Xq)和短臂(Xp)基因组学比较分析

X染色体发生X染色体失活 ,但是Xp基因有 30 %表现为逃逸 ,而Xq仅不到 3%。为了研究X染色体基因失活和表达逃逸发生和维持的分子机制 ,比较了Xq和XpDNA序列的RNA模拟结合强度。X染色体的核苷酸序列被分为 5 0kb一段 ,对每一段DNA做 7碱基 (7nt)字符串组合分析 (共有 4 7=16 384种组合 ) ,记录每段 5 0kbDNA中每种 7nt字符串的频率。选择生发中心B细胞中的 12 0个高表达基因 ,计算这些基因的内含子 7nt字符串的出现频率 ,称为intron 7nt,以此作为RNAs(RNA群 ,模拟细胞中RNA在小片段的总和 )。已知一段DNA序列的 7nt频率值和intron 7nt,即可以计算该DNA段与intron 7nt的结合强度。每段 5 0kbDNA与intron 7nt的结合强度取决于该DNA段与intron 7nt互补核苷酸的频率 ,互补的核苷酸序列越多 ,结合强度就越大。DNA段与intron 7nt的模拟结合强度称为RNA结合强度 ,试图模拟该段DNA可以结合的RNA小片段的总量。之所以采用 7nt字符串组合分析是考虑到连续 7个核苷酸互补则可以形成相对稳定的结合。研究发现 :1)Xp各DNA段的RNA结合强度均值显著大于Xq (P <0 0 0 1) ;2 )Xp上高结合RNA的DNA段数目显著高于Xq (P <0 0 0 1) ;3)RNA高结合DNA段形成的簇与X染色体基因表达逃逸区关联。有证据表明 ,RNA可以通过改变染色质     

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶 (ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA, sgRNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sgRNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。     

薯蓣和叉蕊薯蓣叶绿体基因组及特异性DNA条形码鉴定序列筛选研究

前期研究表明,目前常用的DNA条形码序列对薯蓣属物种的鉴定效率低.本研究利用高通量测序技术测定了薯蓣(Dioscorea opposita)和叉蕊薯蓣(D.collettii)叶绿体基因组,完成了其物理图谱绘制,基因组结构特征解析,特异性DNA条形码序列的筛选.薯蓣和叉蕊薯蓣叶绿体基因组总长度分别为152963和153870 bp,均包含两个反向重复区(IRs)、一个大单拷贝区(LSC)和一个小单拷贝区(SSC)4部分.薯蓣和叉蕊薯蓣均含有125个基因,其中包含87个蛋白编码基因、30个t RNA和8个r RNA.薯蓣和叉蕊薯蓣的GC含量分别为37.04%和37.17%,经多序列比对发现薯蓣属叶绿体基因组中非编码区变异高于保守的蛋白编码区域,LSC区、SSC区变异大于IR区,筛选出了10个潜在的适合作为鉴定薯蓣属植物的特异性DNA条形码序列,其中包括5个蛋白编码基因和5个基因间隔区.系统进化树显示,叶绿体全基因组序列也可作为薯蓣属物种鉴定的超级条形码.本研究为薯蓣属系统进化以及物种鉴定等领域的研究提供依据.     

鸡端粒酶RNA基因的克隆

本研究采用扩增条件优化的PCR扩增技术,以MDCC-MSBl细胞基因组DNA为模板扩增出鸡端粒酶RNA(chicken telomerase RNA,chTR)全长基因,克隆到pMD18-T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定后测定序列.序列分析表明所克隆的鸡端粒酶RNA基因全长465 bp,其中模板区的11个核苷(5'-CUAACCCUAAU-3')合成端粒亚单位(TTAGGG)n.chTR基因的克隆为进一步研究chTR在马立克氏病发病过程中的作用以及马立克氏病的发病机制提供可能的序列基础.     

长链非编码RNA AFAP1-AS1促进肿瘤侵袭转移

<正>人类基因组计划及其后续的DNA元件百科全书计划(The Encyclopedia of DNA Elements Project,ENCODE)研究成果表明,蛋白质编码基因序列仅占人类基因组序列的1%~3%,人基因组中绝大部分可转录的序列为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNAs)[1].Lnc RNA广泛地存在于各种生物中,且随着生物复杂程度的升高,基因组中lnc RNA序列的比例也相应地增大,提示lnc RNA在生物进化过程中可能有着重要意义[2-4].随着     

RNA干扰技术及应用的研究进展

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异的基因沉默现象,RNAi效应具有高特异性和高效性的显著特征,能够在细胞和子代间传递.除诱导同源序列mRNA降解或阻止其翻译而使目的基因表达受阻的转录后基因沉默外,RNA干扰可通过组蛋白甲基化影响染色质结构、通过DNA甲基化在转录水平调节基因表达,在翻译水平调节机体发育,并作为基因组的免疫系统,使转座因子或重复序列区域异染色质化,有效抑制了转座子和重复序列之间的同源重组对基因组可能造成的破坏,使生物基因组在长期进化过程中能保持结构的完整性和遗传的连续性. RNA干扰以阻抑基因的表达来模拟基因敲除技术,为反向遗传学研究基因功能提供了一种快速和简便的方法.RNA干扰技术日趋成熟和完善,为人们迅速准确地分析基因功能提供了极为有用的工具,同时在临床应用和治疗肿瘤和癌症等方面也有着巨大的应用前景.     

紫稻(Oryza sativa L.)线粒体ATP合成酶atp6基因转录本RNA编辑

紫稻(Oryza sativa L.)细胞质雄性不育系紫稻A是本实验室构建的新型细胞质雄性不育系。本研究使用PCR、RT-PCR、DNA测序等技术,得到了紫稻细胞质雄性不育水稻不育系(樱香A)及其保持系(樱香B)线粒体atp6基因转录本cDNA序列。通过与基因组序列比对发现:樱香Aatp6cDNA序列中,没有发生RNA编辑;而樱香Batp6 cDNA序列中有16个编辑位点,在樱香B cDNA序列16个编辑位点位于15个密码子中,所编码的氨基酸均发生改变:在1003位点由C替换为T,导致原来编码谷氨酰胺密码子(CAA)成为终止密码子(TAA),保证atp6 mRNA编码一个正常的ATP6多肽;而由于没有发生RNA编辑,樱香A mRNA就不能翻译成正常的多肽。研究表明,RNA编辑在合成正常的ATP6多肽的过程中具有至关重要的作用,同时也说明RNA编辑可能与细胞质雄性不育相关。     

甲基绿—派洛宁染色法研究进展

甲基绿—派洛宁染色法(MG-P)既往主要应用于显示细胞DNA和RNA,随着细胞化学定量技术,特别是图象分析技术(ICM)的发展,其研究有了很大发展,目前已应用于细胞DNA/RNA的同时定量分析.本文就这方面的进展作一综述.     

非编码DNA序列的功能及其鉴定

非编码DNA序列是指基因组中不编码蛋白质的DNA序列。这些序列可以结合调节因子、转录为功能性RNA、单独或协同地调节生理活动和病理过程。文章围绕基因表达调控作用, 总结了近几年非编码DNA序列的研究成果, 对其结构、功能和可能的作用机制进行了初步阐述, 介绍了目前鉴定非编码DNA序列中功能元件的计算方法和实验技术, 并对非编码DNA未来的研究进行了展望。     

G-四联体的生物学功能研究进展

G-四联体是一种特殊的核酸二级结构,广泛存在于人类基因组DNA以及RNA中,如DNA的端粒序列、基因的启动子序列、RNA的5'端非翻译区(5'UTR)序列等。许多研究发现,G-四联体结构在基因的稳定性、端粒合成过程、基因转录和翻译水平的表达调控、基因重组等生命过程中起着至关重要的作用。目前的研究主要涉及DNA中的G-四联体、RNA中的G-四联体以及人工设计的G-四联体寡聚核苷酸,本文将从这三个方面介绍G-四联体的生物学功能相关研究进展。     

甜瓜CmERFIII-1转录因子基因cDNA的克隆与表达分析

根据甜瓜ERF亚家族成员聚类结果,选取第三亚群的Cm ERFIII-1(甜瓜基因组数据库登录号MELO3C005465)基因为研究对象,根据其c DNA序列设计基因特异引物,应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜果实的总RNA中克隆得到Cm ERFIII-1基因c DNA,序列长711 bp,编码236个氨基酸组成的多肽。序列比对及系统发育分析表明,Cm ERFIII-1 c DNA编码的蛋白质氨基酸序列与黄瓜中ERF亚家族两个成员的序列(Gen Bank登录号:XP_004143677.1、XP_004158119.1)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甜瓜根、茎、叶和授粉后不同时期果实中均有不同程度表达,在叶片中表达量最高。