LncRNA ZNF667-AS1靶向 miR-31-5p对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的机制研究

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)ZNF667-AS1通过靶向miR-31-5p对食管癌细胞增殖和迁移的影响及潜在的机制。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测ZNF667-AS1在食管癌细胞Eca109、EC1、TE1和正常食管上皮细胞Het-1A的表达水平,并选择表达差异最大的细胞株进行后续实验。采用脂质体转染技术将pcDNA3.1-ZNF667-AS1过表达重组载体质粒转染至人食管癌Eca109细胞,实验分为对照组(未行转染的Eca109细胞)、pcDNA3.1组(转染空载体质粒的Eca109细胞)和ZNF667-AS1组(转染pcDNA3.1-ZNF667-AS1质粒的Eca109细胞),qPCR技术检测pcDNA3.1-ZNF667-AS1的转染效果,噻唑蓝比色法(MTT)和平板克隆实验检测过表达ZNF667-AS1对Eca109细胞增殖能力的影响,Transwell实验检测Eca109细胞迁移能力,流式细胞术检测Eca109细胞凋亡率,Western blot检测Eca109细胞中G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)、上皮标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、间充质标志物神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白X(Bax)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达水平,生物信息学预测ZNF667-AS1与miR-31-5p的互补配对关系,荧光素酶报告实验和qPCR技术验证ZNF667-AS1和miR-31-5p的靶向调控关系。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果与Het-1A细胞相比,食管癌Eca109、EC1和TE1细胞中ZNF667-AS1的表达水平均降低(1.00±0.08比0.29±0.04,0.36±0.05,0.33±0.06),差异有统计学意义(P<0.001)。与ZNF667-AS1组相比,对照组及pcDNA3.1组中ZNF667-AS1的表达水平(3.14±0.32比1.00±0.10,0.94±0.09),细胞活力[(63.42±3.75)%比100.00±4.85、(97.69±4.57)%],细胞克隆形成数[(34.26±3.52)个比(95.64±10.22)个、(92.80±10.04、个],Cyclin D1表达水平(0.26±0.05比0.75±0.08、0.71±0.07),迁移细胞数[(20.24±2.35)个比(63.55±6.04)个、(60.02±6.12)个],细胞中E-cadherin表达水平(0.19±0.02比0.48±0.05,0.49±0.05)和miR-31-5p的表达水平(0.30±0.03比1.00±0.10,0.95±0.09)均升高,p21表达水平(0.79±0.09比0.24±0.05,0.26±0.06),细胞凋亡率[(29.17±1.26)%比(3.41±0.73)%,(3.72±0.78)%],细胞中N-cadherin(0.87±0.09比0.42±0.04,0.40±0.04)、Vimentin表达水平(0.82±0.08比0.44±0.04,0.44±0.04)均降低,差异有统计学意义(P均<0.001),与对照组比较,pcDNA3.1组ZNF667-AS1的表达水平,细胞活力,细胞克隆形成数,Cyclin D1和p21表达水平,迁移细胞数,细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和miR-31-5p表达水平,细胞凋亡率差异无统计学意义(P均>0.05)。生物信息学预测发现ZNF667-AS1和miR-31-5p存在靶向结合位点;荧光素酶报告实验结果显示,与空载转染组比较,miR-31-5p组ZNF667-AS1-Wt相对荧光素酶活性(1.00±0.10比0.19±0.02)降低(P<0.05),ZNF667-AS1-Mut相对荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达ZNF667-AS1能抑制食管癌Eca109细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡,其机制可能与ZNF667-AS1靶向调控miR-31-5p有关。     

人工饲养东方白鹳繁殖期行为的时间分配

对哈尔滨动物园一对东方白鹳(Ciconiaboyciana)繁殖期行为的时间分配做了观测分析,统计在某个时间单位(如孵化期)及整个繁殖期各行为所占的比例,比较得出东方白鹳因性别、繁殖期阶段等不同因子在行为上产生的差异。结果表明,繁殖期笼养东方白鹳的行为及其时间分配主要为站立(4 9 4% )、繁殖(1 9 7% )、理羽(8 9% )、取食(6 4% )、修巢(5 7% )、打嘴(5 7% )、游走(4 3 % )等几种,各种行为时间分配存在着一定的日节律。繁殖期的不同阶段、不同性别之间行为时间分配存在着一定的差异。     

浅谈转基因克隆动物技术

根据现有理论和技术发展趋势,提出了转基因克隆动物的概念,即将克隆动物与转基因克隆动物技术有机地结合起来,认为转基因克隆动物制作 技术将有望成为下一世纪创建遗传工程动物的主导性技术。     

人CD55基因的克隆及其转基因构件的组装

本实验采用人肝组织作为RNA的来源 ,经RT -PCR扩增得到CD55基因的cDNA片段。与人α -珠蛋白启动子及其polyA序列重组 ,插入质粒载体pGEM - 5zf,获得了可用于受精卵原核显微注射的基因构件 ,为建立人CD55转基因动物模型奠定了基础。     

tPA cDNA在兔乳腺中的表达(英文)

组织型纤维原激活剂（tPA）的作用是激活血纤维蛋白酶原,从而溶解血栓。生物体内tPA的含量很低,远远不能满足临床需要。为了利用转基因动物生产tPA,需要对所用tPA乳腺表达载体pSVL－WAP－tPA2（Fig．1）进行予证。将三种待研究载体分别用脂质体包埋,注入中后期怀孕母兔乳腺。对乳汁、乳腺组织的mRNA和DNA分别进行检测。实验兔分娩后,每4天取乳汁冻存,ELISA检测其中tPA含量（Fig．2）,泌乳期第4天最高可达600ng／ml。又,于乳腺注射第3天,手术切取部分乳腺组织,制备总RNA,以β－Casein启动子下游序列（TACTAG…）为引物Ⅰ,tPA上游序列（TTCCCA…）为引物Ⅱ,做RT－PCR检测,表明：此时已有tPAmRNA转录（Fig．3）。再,于停乳后30天左右,切取部分乳腺制备DNA,以tPAcDNA为探针,做Southern杂交检测,表明：无tPA整合,仅是以附合体形式存在（Fig．4）。上述质粒直接注射技术是予证转基因用载体表达水平的快捷、简便方法。     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３ ＤＮＡ为载体,通过克隆绿色木酶（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉ－ｒｉｄｅ）高分子量基因组ＤＮＡ的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Ｅｓｃｈｅｒｉ－ｃｈｉａ．ｃｏｌｉＫ８０２,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的末端片段为探针,用轮回噬菌斑原位杂交从文库中筛选出ＣＢＨＩＩ基因的阳性克隆５个     

肺炎支原体肺炎伴喘息儿童血清25(OH)D_3、Th17/Treg表达水平与肺功能的关系

目的:探讨肺炎支原体肺炎伴喘息儿童血清25羟基维生素D3[25(OH)D_3]、辅助性17细胞/调节性T细胞(Th17/Treg)表达水平与肺功能的关系。方法:将新疆医科大学第五附属医院收治的肺炎支原体肺炎伴喘息患儿26例作为肺炎伴喘息组,肺炎支原体肺炎不伴有喘息患儿54例作为肺炎不伴喘息组,另选取健康儿童30例作为对照组,比较各组血清25(OH)D_3、白细胞介素(IL)-10、IL-17、Th17细胞及Treg细胞占CD4+T细胞比例及肺功能,并分析其相关性。结果:肺炎伴喘息组血清25(OH)D_3、IL-10、Treg细胞占CD4+T细胞比例低于肺炎不伴喘息组、对照组,Th17细胞占CD4+T细胞比例、Th17/Treg、IL-17高于肺炎不伴喘息组、对照组(P0.05)。各组第一秒最大呼气量占用力肺活量百分比(FEV1/FVC)比较差异无统计学意义(P0.05),肺炎伴喘息组FEV1占预计值百分比(FEV1%pred)、峰值呼气流量(PEF)低于肺炎不伴喘息组、对照组(P0.05),肺炎不伴喘息组与对照组FEV1%pred、PEF比较无统计学意义(P0.05)。肺炎伴喘息组患儿血清25 (OH)D_3与Th17/Treg、IL-17呈负相关(P0.05),与IL-10、FEV1%pred、PEF呈正相关(P0.05),血清Th17/Treg与IL-10、FEV1%pred、PEF呈负相关(P0.05),与IL-17呈正相关(P0.05)。结论:肺炎支原体肺炎伴喘息儿童血清25(OH)D_3、Th17/Treg表达水平异常,肺功能下降,且25(OH)D_3、Th17/Treg表达水平与肺功能相关。     

高等转基因动物基因发育特异性表达调控研究

一、前言最初研究高等动物基因表达调控采用的是细胞融合技术,然而细胞融合只能把两套基因组合并而并不能有选择地把特定的基因转入到细胞中。基因工程的诞生克服了如上的不足,推动了基因表达调控的研究。但在早期由于理论和技术的限制也只能把外源基因导入体外培养的动物细胞中,此法因局限于部分分化或完全分化的细胞中,故仍难于直接揭示胚胎发育过程中基因表达的动态分子机     

禽类的基因转移

动物基因转移技术用得最早最多的是微注射法,鱼类因是体外受精受精卵易于获取,哺乳动物则因受精卵原核较大易于进行遗传操作,所以,这两类动物的转基因研究起步较早,进展也很快。禽类因难于用微注射法直接对受精卵进行操作,故其转基因研究的进展较慢。最早进行禽转基因途径的尝试,是Pandey和Patehell(1982)用辐射处理精子,因此法转入的DNA是完全随机的,故难于实现目标基因的转移。Souza(1984)用反转录病毒作为载体,通过感染幼鸡而导入,使外源鸡生长激素(cGH)基因得到了表达,血浆cGH水平增高,但转基因鸡并无促生长效应。后来,Scanes和Leung(1986)给鸡注射外源cGH,发现试验鸡仅早期有增重效果,1月龄之后与对照组则无体重差异。故近年     

植物质体的观察

叶绿体城市学校可选用菠菜或白菜叶作材料。撕下叶片下表皮,用刀片刮取少量叶肉,放在滴有一滴10—20％糖液的载玻片上,使叶肉分散在糖液中,盖上盖片即可观察。山区学校可用藓类做材料(一般为单层细胞)。取藓叶一片。制成装片即可观察。白色体取马铃薯或甘薯,徒手切片或洋葱鳞片表皮制成装片即可显微观察。可见在细胞核周围有一些无色透明的圆形颗粒,这就是白色体。在农村或山区,以鸭跖草嫩叶下表皮为材料进行装片后观察效果更好。