H2O2参与棉疫病菌90 kD蛋白激发子诱导的烟草过敏反应和系统获得抗性

野生型烟草Bel-W3叶片经棉疫病菌90kD蛋白激发子处理后,处理叶及其上位叶在24h内均发生2次氧化迸发产生H2O2,且第二次H2O2进发高峰期同时出现,均出现在第12小时,处理部位细胞死亡高峰期比第二次H2O2迸发高峰期滞后8h。引起过敏反应剂量的激发子诱发反义抑制抗坏血酸过氧化物酶anti-APX烟草的过敏性坏死枯斑比野生型的大而且出现得早;不能诱发野生型烟草HR的剂量可以诱导anti-APX烟草发生HR。经激发子处理后anti-APX烟草对烟草疫霉(Phytophtora nicotianae)和TMV产生的诱导抗性比其野生型高。上述结果表明,H2O2可能是一种重要的信号分子,在棉疫病菌90kD蛋白激发子诱发烟草的HR和SAR中具有重要作用,但可能不是一种可以系统移动的信号分子。     

磷脂酶D对ParA1诱导的烟草的细胞死亡和过氧化氢及莨菪亭积累的影响

利用药理学方法,研究了烟草寄生疫霉(Phytophthora parasitica)分泌的蛋白激发子ParA1诱导烟草悬浮细胞后,磷脂酶D对ParA1诱导的过敏细胞死亡和其它防卫反应的影响.用100nmol/LParA1处理烟草悬浮细胞后能够诱导细胞死亡、过氧化氢和莨菪亭的积累.磷脂酶D抑制剂正丁醇能够抑制ParA1诱导的这些防卫反应,仲丁醇所起的抑制作用比正丁醇小,正丁醇和仲丁醇产生的抑制效果具有浓度依赖效应.而叔丁醇不能抑制ParA1诱导的这些反应.结果表明,磷脂酶D参与了ParA1诱导烟草悬浮细胞的信号传导过程.     

蛋白激发子Hrip1互作蛋白的筛选及其原核表达

蛋白激发子Hrip1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离纯化出的一种新型超敏反应诱导蛋白,能激发烟草、拟南芥和水稻等多种植物的免疫防御反应,提高广谱抗病性。为了探究Hrip1诱导植物抗性反应的分子机制,以Hrip1为诱饵蛋白,通过酵母双杂交,在水稻c DNA文库中筛选Hrip1的互作蛋白。经回转验证和x-a-gal染色得到了一个Hrip1互作蛋白-CSN5。构建了互作蛋白CSN5的原核表达载体pGEX-6P-2-CSN5,并转化大肠杆菌表达菌株BL21。经IPTG诱导后获得了可溶性的融合表达蛋白,用GST亲和层析柱纯化获得单一条带的融合表达蛋白,并用Western blot鉴定了融合表达蛋白的正确性。研究结果为进一步鉴定Hrip1的互作蛋白及其功能奠定了基础。     

真菌蛋白激发子PevD1互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达

PevD1是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)发酵液中分离纯化的一种新蛋白激发子,能激发烟草和棉花的免疫防御反应,提高抗病性。旨在深入研究PevD1的作用机理,利用酵母双杂交系统,以PevD1为诱饵蛋白,筛选拟南芥中PevD1的互作蛋白,经复筛、回转验证得到3个候选互作蛋白基因R1,R2和R4。利用同源克隆技术获得烟草中互作蛋白编码基因NR1、NR2和NR4;经酵母双杂交验证其中的NR2蛋白能与PevD1特异性结合。利用原核表达系统,成功构建了重组表达载体pMAL-C2XNR2并转化大肠杆菌细胞,经IPTG诱导获得了可溶性表达的NR2融合蛋白。     

蛋白激发子PeaT1的高密度发酵及生理功能检测

PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中提取出的一种植物蛋白激发子,具有促进植物生长,增强作物抗逆性的功能.由于该蛋白具有无残留、无毒副作用的优点,因此具有发展为生物农药的应用前景.在100 L发酵罐中利用分批补料技术对PeaT1工程菌进行高密度发酵,通过AKTA蛋白纯化仪对发酵产物进行了亲和纯化,并检测了纯化所得蛋白对水稻在15℃低温下生长的影响.发酵最终菌体密度达80 g/L,每升菌液纯化得到蛋白90 mg,纯化所得蛋白能够促进水稻低温下的生长,具有激发子活性.     

一步柱层析纯化螺旋藻藻蓝蛋白

采用硫酸铵盐析结合疏水层析技术分离纯化螺旋藻中的藻蓝蛋白.试验结果表明,在磷酸盐缓冲体系下藻蓝蛋白粗提液经1.25 mol/L硫酸铵盐析处理后离心脱气,只需采用一步Macro-Prep Methyl 疏水层析,藻蓝蛋白的纯度（A620/A280）可提高到4.017,回收率为19.38%.特征吸收峰和荧光光谱证实纯化后的产物符合藻蓝蛋白的性质,Native-PAGE电泳只出现单一染色带,表明纯化得到的藻蓝蛋白是均一的;SDS-PAGE电泳出现分子量为15.4 kDa、17.3 kDa的2条染色带,分别为藻蓝蛋白的α亚基与β亚基.     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

重组沙蚕激酶的诱导表达和分离纯化

将已构建好的表达载体pGEX-4T-2SAK 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合的沙蚕激酶蛋白,通过GST树脂亲和吸附和凝血酶酶切及冷冻干燥等步骤进行分离纯化,用SDS-PAGE分析要重组的目的蛋白及纯化后的蛋白.纯化后的沙蚕激酶经纤维平板法测定具有溶栓活性.冷冻干燥品经SDS-PAGE分析表明达到电泳纯.     

毛白杨NBS型基因PtDRG01原核表达研究

为了分析毛白杨NBS型抗病基因PtDRG01(EF157840)编码蛋白的特性,研究构建了该基因的原核表达载体pGEX-Pt01,并导入大肠杆菌XA90,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析证明,该特异蛋白的分子量约为79kD。对原核表达体系以及融合蛋白的表达特性进行优化与分析表明:最佳诱导表达条件为1mmol/L IPTG在37℃下诱导4h,所表达的融合蛋白为胞内分泌的可溶性蛋白。利用谷胱苷肽-琼脂糖亲和层析柱纯化获得了电泳纯级的目标蛋白,为PtDRG01基因编码蛋白的功能鉴定研究奠定了基础。     

细胞色素c(Cyt c)诱导烟草悬浮细胞(BY-2)凋亡

用不同浓度细胞色素c(Cyt c)诱导继代时间不同的烟草悬浮细胞48 h后观察形态学特征的结果表明,继代培养10和13 d的细胞均在10 mmol·L-1Cyt c时出现最高的细胞凋亡率,而继代5 d的细胞在Cyt c浓度为12.5 mmol·L-1时细胞凋亡的诱导率仍表现上升趋势;DNA电泳检测结果显示凋亡处理的细胞中DNA呈现较明显的DNA梯度.