HaSNPV的9个基因的转录谱分析

使用反转录和实时荧光定量PCR技术,我们对HaSNPv的几个预期的早期基因、早晚期基因、晚期基因、极晚期基因的转录时相进行分析,结果表明这些基因的起始转录时间与其自身的启动子类型基本是一致的.但是预期的早期基因pkip晚期才开始转录;预期的早晚期基因ha107早期不转录,仅在晚期转录.这些基因的转录水平一般都在病毒感染细胞72 h后达到最高,并且极晚期基因polyhedrin的转录水平明显高于其它基因.Iap2的转录水平仅次于polyhedrin,表明它可能是一个功能基因.与AcMNPV的p10不同,在HaSNPV/HzAM1系统中p10的转录水平并不高.     

棉铃虫核多角体病毒p10基因的序列及转录分析

为了利用棉铃虫核多角体病毒（HaSNPV）p10基因的启动子构建重组病毒杀虫剂及表达系统,应用末端测序法和引物步移法测定了p10基因的序列,并应用Northern杂交和引物延伸实验对该基因进行了深入的转录特性分析,HaSNPV p10基因被定位于基因组DNA的115.4kb-115.6kb处,转录方向与多角体基因相反,在其上下游分别发现了p26和p74基因。转录分析结果确定了p10基因是个极晚期基因,其转录从杆状病毒晚期转录保守序列GTAAG的第二个A开始,转录产物大小约为430nt。HaSNPV p10基因最早可检测到的转录是在病毒感染后的20h,随后其转录产物量迅速放大,到感染后72h达到非常高的水平。围康时相分析同时还检测到一个大小为1300nt的产物,推测该产物为p26和p10通读的转录产物。对HaSNPV P10蛋白序列的分析表明,该蛋白第6－44位及第51－65位氨基酸序列处含多个典型的卷曲螺旋七聚体重复结构,两片段间相隔6个氨基酸残基,在该蛋白序列的第20－34位与第51－65位存在L－X（2）－L－X（10）－L的亮氨酸重复。Helical net分析表明,HaSNPV P10的疏水氨式酸分布为两个集簇区,两者互为180度转角。     

棉铃虫核型多角体病毒基因组结构及p10基因

用BamHI、EcoRV、HindⅢ、KpnⅠ、PstⅠ和XbaⅠ六种限制性内切酶消化HaSNPV C1株基因组DNA,电泳后形成的大于400bp的片段数分别为11、31、13、6、7和25条。预计整个基因组长度为137.7kb左右。构建了HaJSNPV基因组6种限制性内切酶的物理图谱,并在图谱上定位了5个同源重复区hr1、hr2、hr3、hr4和hr5以及多角体蛋白(ph）基因、极早基因（ie1)、p10、几丁质酶（chitinase）基因、DNA聚合酶基因（DNApol）、解旋酶（helicase）基因、超氧化物歧化酶基因(sod）、碱性外切核酸酶基因（alk-exo）、蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖转移酶基因（egt）。HaSNPV的基因组结构与其他已知的病毒表现了很明显的差异。p10基因位于BamHI-Ⅰ片段（1.89kb)上,其转录方向与多角体蛋白基因（polh）相反。p10上游为p26基因,下游为p74基因,p26和p10基因转录方向一致,p74基因转录方向与前两者相反。p10基因编码区全长261bp,可编码分子量为9.3kD ,由87个氨基酸残基组成的多肽。编码区上游是一个富含AT区,在起始密码子ATG上游－52bp处有杆状病毒晚期基因启动子典型的转录起始位点元件TAAG,而在翻译终止密码子TGA下游20bp处有转录终止信号AATAAA。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一。本文通过构建p10缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能。利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因,然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上,构建了p10缺失的重组HaBacΔp10-PH-eGFP。重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装。     

缺失p10基因的重组棉铃虫病毒导致多角体囊膜包装不完整

P10蛋白是杆状病毒感染细胞后在极晚期高度表达的两个蛋白之一.本文通过构建p10 缺失的重组棉铃虫病毒来研究P10的功能.利用λ噬菌体Red重组系统介导的同源重组,在大肠杆菌BW25113中,用含有40bp同源臂的氯霉素抗性基因替换了棉铃虫病毒(HaSNPV)细菌人工染色体HaBacHZ8上的p10基因, 然后利用Bac-to-Bac系统把多角体基因和绿色荧光蛋白基因转移到含有缺失p10的HaBacHZ8上, 构建了p10缺失的重组HaBacΔp10- PH-eGFP.重组病毒的生长曲线和生物测定结果表明,缺失p10基因对病毒复制和毒力无显著影响,但电镜观察结果显示,P10的缺失会影响多角体囊膜的包装.     

bm47基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制及转录的影响分析

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)bm47基因普遍存在于已测序的鳞翅目核型多角体病毒基因组中,是杆状病毒的核心基因之一,但其在病毒复制及转录过程中的具体功能尚未可知。本研究利用Red重组技术在大肠杆菌BW25113中构建了BmNPV的bm47基因缺失型病毒bm47-ko-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了bm47基因的补回型病毒bm47-re-Bacmid。然后利用TCID50病毒滴度测定法和荧光定量PCR等方法研究了缺失bm47基因对病毒复制、转录及蛋白表达的影响。结果表明,bm47基因缺失后对病毒基因组的复制水平没有明显的影响;在病毒转染BmN细胞后48h和72h两个时相,bm47基因的缺失导致病毒早期基因lef3、晚期基因vp39以及极晚期基因p10的转录水平均有一定程度的下降。本研究工作将为深入研究BmNPV bm47在病毒复制和基因转录过程中的生物学功能奠定基础。     

中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒（HaSNPV）HindⅢ-Ⅰ片段的序列分析与基因排列研究

对中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒（HaSNPV)基因组中的HindⅢ-Ⅰ片段的序列进行分析,该片段全长7501nt,包括10个开放阅读框：AcMNPV ORF111的同源基因（Ac 111),晚期表达因子2（lef-2）基因,病毒核壳结构蛋白p24基因、gp16基因、多角体包膜蛋白（polyhedron envelope protein,pep)基因、AcMNPV ORF63的同源基因（Ac63),38.7kD基因,晚期表达因子1（lef-1) 基因,及两个特有基因HaSNPV orf591和HasSNPV orf435。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒囊膜蛋白odv—e66基因及其邻近区域的序列分析

杆状病毒ODV－E66蛋白是包涵体来源病毒（occlusion-derived virus,ODV）囊膜的结构蛋白,ODV囊膜对ODV的稳定性和感染性具有重要作用。本文报道了HaSNPV odv-e66基因及其邻近区域共4237bp的核苷酸序列及其分析结果。HaSNPV的odv-e66基因编码区全长2019bp,推测编码一个由672个氨基酸残基组成的,分子量为74.5kD的蛋白质。在起始密码子ATG上游具有杆状病毒晚期转录起始信号ATAAG。与其他杆状病毒ODV－E66的氨基酸序列比较分显示HaSNPV ODV-E66蛋白具有多个保守区域,包括N末端的强疏水功能区、序列中部的一个可能的核定位信号RKIW,两个Leu-xipper以及5个跨膜区。odv-e66基因上游的两个ORF分别与AcMNPV的orf108和orf109具有同源性,下游的ORF与LsNPV的p13基因具有同源性。     

草鱼出血病病毒基因组体内转录的研究

本文采用α-[~(32)p]ATP标记物在鱼肾细胞系(CIK)系统中,对草鱼出血病病毒(Grass carp hemorrhage virus,GCHV)基因组进行了体内转录的研究。通过放线菌素D抑制宿主细胞基因组的转录活动,从感染病毒细胞中分离出病毒的mRNA,分别采用液相杂交和Nortbern blot方法检查病毒mRNA的转录情况。试验结果表明,GCHV含有内源性转录酶,其基因组的转录活动是在病毒感染细胞后4小时开始,由早期基因所转录,8—10小时获得晚期基因的转录产物。这些mRNA的大小、数目大体上与病毒基因组一致。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒解螺旋酶基因的序列分析

对棉铃虫单核衣壳核多角体病毒（Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV）基因组中EcoR I-N片段进行序列分析,获得了完整的解螺旋酶基因（hel）,其开放阅读框大小为3762bp,编码一个分子量为146kD的蛋白质。在hel起始密码子ATG上游50位有强晚期启动子转录起始信号ATAAG,在－112位和－189位存在两个TATA box,但未发现早期转录信号CAGT。其在终止密码子下游第12位有一PolyA终止信号AATAAA。在其它真核或原解螺旋酶中存在的7个保守基元（Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ）,只有5个（Ⅰ、Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）在杆状病毒中保守。同源性比较发现,HaSNPV解螺旋酶的氨基酸序列与甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigus MNPV,SeMNPV）的解螺旋酶具有最高的同源性（66％）,与Xestia c-nigrum颗粒体病毒（XcGV）解螺旋酶的同源性最低（43％）。HaSNPV解螺旋酶基因是第一个报道的单粒包埋核多角体病毒的解螺旋酶基因。