OAZ1基因诱导慢粒白血病K562细胞向成熟红系方向分化

近年来,鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)作为肿瘤治疗的潜在靶点备受关注.本文研究了OAZ1基因过表达对慢粒白血病K562细胞红系分化的作用.构建框移位点突变的OAZ1 过表达慢病毒载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen,包装病毒并感染K562细胞, Western 印迹验证其过表达效果.FACS检测细胞分化标志物CD71和GPA,结合联苯胺染色分析细胞红系分化情况.对比氯化高铁血红素(hemin)诱导组,实时RT-PCR检测与K562细胞红系分化、癌变的关键基因(GATA1、BCR/ABL、TGFβ)转录水平,对OAZ1 诱导分化的机制进行初步探索.结果表明,慢病毒过表达载体及K562细胞过表达体系构建成功.OAZ1过表达后细胞红系分化标志物CD71+/GPA+为(11.22±2.09)%,与对照组(4.07±1.04)%、空病毒组(1.79±2.36)%相比差异极显著(P<0.01);联苯胺蓝染阳性率为(14.037±0.083)%,与对照组、空病毒组比较,差异也极显著(P<0.01).定 量分析结果提示,相对于GATA1、BCR/ABL 基因mRNA转录水平的影响,OAZ1对TGFβ 基因的作用更为明显.为此推断,OAZ1基因可诱导白血病K562细胞向成熟红系方向分化,其作用机制可能与TGFβ信号转导通路相关.     

DNA甲基化通过锌指蛋白185调控慢性粒细胞白血病细胞的增殖

锌指蛋白185(ZNF185)属于LIM结构域蛋白,参与细胞的增殖和分化,在多种肿瘤细胞中具有抑癌基因的功能.ZNF185在正常人血液系统细胞中高表达,但目前对白血病细胞的作用未见研究.采用Western blot检测人外周血中性粒细胞、急性粒细胞白血病细胞系HL-60和慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞中ZNF185的表达,发现ZNF185在HL-60和K562细胞中的表达水平显著低于外周血中性粒细胞.为了阐明ZNF185对慢性粒细胞白血病细胞增殖的影响,从人外周血中性粒细胞克隆ZNF185编码序列,转染K562细胞,MTT检测细胞增殖,发现过表达ZNF185显著抑制K562细胞的增殖.甲基化特异PCR分析表明:ZNF185启动子在HL-60和K562细胞中高甲基化,用5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理K562细胞,促进ZNF185的表达,显著抑制细胞增殖.研究结果表明,ZNF185启动子高甲基化导致其在K562细胞中的表达降低和细胞增殖抑制作用减弱.可能是慢性粒细胞白血病发生或发展的原因之一.     

氯化高铁血红素诱导K562细胞中β-珠蛋白基因表达的研究

以绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报道基因,构建了在β-珠蛋白启动子驱动及HS2元件调控下的重组表达载体HG,用脂质体转染法将其转染到K562细胞中,并用RT-PCR方法及流式细胞仪检测氯化高铁血红素(Hm)对K562细胞中β-珠蛋白基因表达及重组载体HG在K562细胞中瞬时表达的影响。结果显示：用30μmol/L Hm诱导K562细胞24、48及72h后,不仅其γ-珠蛋白mRNA水平升高,其β-珠蛋白mRNA水平也明显上升,而且这种诱导作用在诱导24、48h后比较明显;Hm还可增强重组表达载体HG在K562细胞中的瞬时表达。提示Hm诱导红系分化的机理可能与γ→β-珠蛋白基因的转换机制相关。 Abstract: The recombinant plasmid HG was constructed,in which the reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was driven by the β-globin promoter and regulated under the HS2 element.The inductive effect of hemin on the expression of the β-globin gene and transiently transfected β-globin genes in K562 cells was analysed by FACS as well as RT-PCR method.The results showed that the level of γ and β-globin gene mRNA in K562 cells increased significantly after 24,48 and 72 hours induced with 30 μmol/LHm.And this inductive effect was sronger after 24 and 48 hours.Furthermore,the transient expression of plasmid HG in K562 cells increased significantly with hemin induction.These results indicated that the mechanism of inductive erythroid differentiation with hemin may be correlated with mechanism of γ→β-globin gene.     

siRNA沉默socs3对红系发育的影响

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.     

miR-24通过靶基因Sp1调控β-类珠蛋白表达

为了研究miR-24对于珠蛋白表达的调控作用,并明确其作用机制.首先采用定量PCR的方法确定miR-24在红系分化过程中的表达变化情况,以及miR-24过表达后珠蛋白的表达变化情况.进而通过报告基因实验以及Western blotting的方法确定miR-24的靶基因.通过表型回复实验证明miR-24是否通过靶基因调控珠蛋白的表达.结果发现在hemin诱导的K562细胞以及EPO诱导的造血干/祖细胞向红系分化过程中,miR-24表达上调,在K562细胞中过表达miR-24可以促进红系分化过程中ε-和γ-珠蛋白的表达上调,进一步的研究表明miR-24是通过靶基因Sp1来行使对珠蛋白的调控作用的.以上结果表明miR-24通过负调节其靶基因Sp1促进红系分化过程中珠蛋白的表达上调.     

莪术醇诱导慢性粒细胞白血病K562细胞分化的研究

目的:以人慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞为对象,研究莪术醇(curcumenol)诱导K562细胞分化作用,并同莪术油做了比较研究。方法:通过测定细胞内酶变化判定莪术醇等诱导K562细胞的分化;用RT-PCR测定莪术醇等作用后K562细胞bcr/abl mRNA表达量的变化,同时测定莪术醇等对K562细胞微核影响,探讨诱导K562细胞的分化机理。结果:莪术醇能够诱导K562细胞向成熟分化,30μg/mL莪术醇作用72h后,Gimsa染色后可见K562细胞向终末细胞分化,出现杆状及分叶核细胞,细胞内酶学指标也呈分化表现;同时,莪术醇作用后bcr/abl融合基因的表达降低,K562细胞的微核率减少。结论:莪术醇对畸变的K562细胞染色体有作用,影响bcr/abl融合基因的表达,使K562细胞向成熟分化。     

脂氧素对K562和HL-60白血病细胞增殖和凋亡的影响(英文)

炎症在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色,脂氧素是一类重要的内源性抗炎介质。但是迄今为止,脂氧素对肿瘤的影响报道极少。为此,本文研究了脂氧素对HL-60和K562白血病细胞增殖和凋亡的影响。体外培养白血病细胞株HL-60和K562,Western印迹和实时荧光定量PCR检测脂氧素受体的表达情况;CCK-8法(cell counting kit-8 assay)检测HL-60和K562的增殖能力;PI染色后利用流式细胞仪进行细胞周期分析;膜联蛋白V试剂盒检测脂氧素对细胞凋亡的影响。实验结果表明脂氧素抑制HL-60和K562白血病细胞增殖(P0.05);脂氧素处理组S期细胞比例明显减少而G_0/G_1期细胞比例增加;脂氧素还可以诱导HL-60和K562白血病细胞凋亡。由此可见,脂氧素抑制HL-60和K562白血病细胞增殖,其机制可能与诱导白血病细胞G_0/G_1期阻滞和细胞凋亡有关。     

铁剥夺在TPA 诱导K562 细胞分化中对细胞 生长分化及EGR1mRNA 表达的影

目的：通过,IPA诱导K562细胞分化过程中干预细胞铁代谢探讨白血病细胞铁与细胞分化的关系及对EGR1mRNA表达的影响。方法：应用体外细胞培养技术通过细胞形态,细胞化学染色观察细胞生长分化情况;用FCM、RT—PCR等技术检细胞周期、细胞表面分化抗原CD33、CD14及EGR1mRNA的表达。结果：在,IPA诱导K562细胞分化过程中铁剥夺可明显抑制K562细胞生长,并可阻止,IPA诱导K562细胞分化,使K562细胞停止在S期。铁剥夺可降低,TPA诱导K562细胞分化过程中EGR1mRNA的表达。讨论：铁剥夺明显抑制K562细胞生长、阻止TPA诱导K562细胞分化,故铁剥夺剂（DFO）可能作为一种辅助抗癌药用于白血病的化疗,但由于它能阻止白血病细胞的分化,故不宜用于白血病的诱导分化治疗。铁剥夺使K562细胞分化过程中E—GR1mRNA表达降低可能参与了阻止TPA诱导K562细胞的分化过程。     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562 细胞凋亡及其对Bax、Bag-1 表达的影响

目的:探讨二烯丙基二硫(Diallyl disulfide)诱导白血病K562细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色法观察细胞凋亡形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯度带;RT-PCR法检测BAG-1、BAX基因的mRNA表达变化。结果:DADS可诱导K562细胞凋亡。其对K562细胞的凋亡效用与药物浓度、有明显依赖关系;DNA琼脂糖凝胶电泳示:40mg/LDADS作用K562细胞48小时后能够产生明显的梯形电泳图谱(DNA ladder):DADS作用48h后,BAX mRNA表达水平较对照组上调;BAG-1 mRNA较对照组下调(差异具有统计学意义,P<0.05)。结论:DADS能够诱导K562细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调BAX,下调BAG-1有关。     

Nrf2/HO-1/HMGB1信号通路在白血病细胞K562/A02化疗耐药中的机制研究

目的:通过观察高迁移率族蛋白1(HMGB1)、转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)及血红素加氧酶1(HO-1)基因沉默对白血病化疗耐药细胞(K562/A02细胞株)的影响,探讨该信号通路在白血病化疗耐药中的作用及其可能机制。方法:将HMGB1基因、Nrf2基因及HO-1基因的特异性干扰RNA分别转染阿霉素耐药细胞株K562/A02,荧光实时定量(RT-PCR)方法检测HMGB1、Nrf2及HO-1的mRNA表达水平,Western blot方法检测HMGB1、Nrf2及HO-1的蛋白表达水平,免疫荧光方法检测Nrf2的蛋白表达,并使用CCK-8方法检测转染前后K562/A02细胞株的细胞活性。结果:HMGB1基因、Nrf2基因或HO-1基因沉默的K562/A02细胞活性皆显著低于对照组及空白组(P0.05),化疗敏感性恢复。结论:HMGB1高表达导致了白血病细胞株K562/A02对阿霉素的化疗耐药,Nrf2/HO-1信号通路参与了HMGB1诱导的K562/A02细胞的化疗耐药,其表达上调可恢复K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。