用人DNA介导的基因转移修复中国仓鼠细胞的HPRT缺陷

 中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)经N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变和6-巯基鸟嘌呤(6-TG)选择,得到稳定的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷细胞株,酶活性仅为野生型的6.5％。用磷酸钙共沉淀法和电脉冲法向HPRT-细胞转移人宫颈癌细胞(HeLaS_3)基因组DNA,纠正了CHO细胞的HPRT缺陷。酶活性提高了6.9倍,达到野生型的45％。用Alu序列探针进行分子杂交,证实经过基因转移并连续传代15次以上的受体细胞中含人DNA序列。表明人的有关基因已稳定地整合到CHO细胞的染色体中。     

HGPRT缺陷性人结肠癌细胞株的建立

本研究首先用化学突变剂乙基甲磺酸(EMS)处理人结肠癌细胞系CCL187,然后用嘌呤类似物8-氮鸟嘌呤(8-AG)筛选次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖酶缺陷细胞(HGPRT~-),历时半年,成功获得抗8-AG毒性突变体,即HG-PRT缺陷细胞株MCL187。该缺陷株细胞HG-PRT酶活性显著低于野生型细胞,在8-AG中能够存活,在HAT选择性培养基中则死亡,与野生型细胞同样表达结肠癌相关抗原LEA。此缺陷株的成功建立,为杂交细胞制备及其应用研究奠定了基础。     

小鼠淋巴细胞杂交瘤的电融合

本文报道我们用电场成功地诱导小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并筛选得到杂交细胞。 材料与方法 细胞对HAT敏感的SP2/0骨髓瘤细胞用RPMI 1640培养基(RPMI 1640培养液加15％小牛血清)培养,淋巴细胞取自活杀的小鼠脾。     

用于大量制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术(续)

三、杂交瘤细胞的选择性培养由于脾细胞同骨髓瘤细胞的混合物。在经过上述融合处理后,不是所有的细胞都能融合。再加,细胞融合本身又是一随机过程,除脾、瘤二细胞间的融合外,还伴有脾细胞与脾细胞及瘤细胞与瘤细胞间的自身融合。因此,紧随细胞融合之后,即应迅速将其移入含有HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶核苷)     

单克隆抗体的制备策略和方法

<正>I 序言 得到能持久地产生针对一事先确定的免疫原的特异抗体的细胞系是在1975年第一次报导的。其方法是基于骨髓瘤细胞与适当免疫的动物的脾细胞的融合。脾细胞在一般组织培养条件下短期内即死亡。骨髓瘤细胞已适应性地能持续培养,再由其中分离到缺少次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶(抗-8氮鸟嘌呤)     

柯萨奇病毒的细胞受体单克隆抗体的制备与鉴定

Hela细胞免疫BALB/C小鼠,取鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用细胞保护试验筛选到了抗细胞受体的抗体。二个细胞系分泌的抗体能封闭Hela细胞上的受体,阻止柯萨奇病毒的感染。     

利用CRISPR/Cas9系统构建人HPRT1基因定点突变细胞株

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1 (HPRT1)基因突变会导致次黄嘌呤和鸟嘌呤代谢异常,严重的代谢障碍被称为Lesch-Nyhan综合征,表现为智力低下,行为上出现强迫性自我毁伤,并伴随痛风或肾结石等症状。HPRT1基因具有多种突变模式,近年来对其突变谱的研究表明该基因具有一些"突变热点"。本研究选取了导致翻译提前终止的热点突变c.508CT突变和c.151CT突变,在HEK293T和HeLa细胞中,以单链寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作为同源重组模板,利用CRISPR/Cas9技术构建了这两种突变的单克隆细胞株,发生定点突变的效率分别为16.3%和10%。进一步通过Westernblot检测点突变的单克隆细胞的HPRT1蛋白表达水平,通过6-TG毒性实验检测点突变的单克隆细胞的次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性,结果表明纯合突变的单细胞克隆不能正常表达HPRT1蛋白,其次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性丧失;杂合突变的单细胞克隆的HPRT1蛋白表达量降低,仍具有部分次黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶活性。HPRT1基因定点突变细胞模型的建立可为今后建立其他HPRT1基因突变的细胞系或动物模型提供借鉴,为研究Lesch-Nyhan致病机制提供基础。     

抗iLRP单克隆抗体的制备和鉴定

为了研究抗iLRP (Immature laminin receptor protein)单克隆抗体在免疫治疗中的应用,本研究采用重组iLRP对6~8周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合,在HAT (Hypoxanthine aminopterin thymidine)半固体培养基上挑选分离明显的细胞克隆于96孔板培养后,取上清液通过ELISA法进行克隆筛选,初次筛选得到23株阳性克隆,复筛后得到13株稳定分泌抗体的细胞株。抗体类别鉴定显示,其中9株为IgM,3株为Ig G1,1株为IgG2a,轻链类型都为κ型。其中1株IgG1和IgG2a用于制备小鼠腹水,经Protein-G柱纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,Western blotting验证抗体特异性。结果表明,抗体纯度均大于90%,并与i LRP有明显的特异性结合。此结果为后续的深入研究提供了一套完整有效的抗iLRP单克隆抗体生产和鉴定的程序,对以iLRP为治疗靶点的单克隆药物研究以及最近兴起的CAR-T (Chimeric antigen receptor modified T cell)免疫治疗具有积极的意义。     

狂犬疫苗单克隆抗体制备过程中细胞融合条件的探索

在充分了解SP2/0细胞系的生长、增殖和遗传特性后,以聚乙二醇(PEG)诱导动物细胞融合为契机,意在探索不同分子量、不同浓度的PEG作融合剂对诱导SP2/0细胞与脾细胞融合的最适条件,在HAT选择培养基下通过细胞融合率的变化进行比较。结果表明,分子量为4000,浓度为50%的PEG诱导的细胞融合率最高,为下一步制备狂犬病毒疫苗单克隆抗体奠定基础。     

BRCA1相关蛋白1对肾癌增殖和侵袭的实验研究

目的:研究BRCA1相关蛋白(BRCA1-associated protein-1,BAP1)对肾癌细胞增殖和侵袭的影响。方法:通过含有不同BAP1和HAT1载体的慢病毒感染后用嘌呤霉素筛选的方法在肾癌细胞系中构建BAP1稳定低表达、HAT1稳定高表达、HAT1稳定低表达以及BAP1低表达且HAT1低表达的慢病毒细胞稳转株。通过WB和PCR验证BAP1在肾癌细胞系中对于HAT1的调控。使用CCK-8细胞增殖和TRANSWELL侵袭实验检测对于肾癌细胞增殖和侵袭能力的影响。利用免疫组化和临床回访数据分析其临床意义。结果:肾癌细胞系中BAP1表达降低后HAT1表达升高。BAP1低表达部分通过了HAT1表达升高促进肾癌的增殖和侵袭能力。在肾癌组织中BAP1的表达与HAT1表达具有相关性(P0.05)。结论:BAP1敲低的肾癌细胞中HAT1特异性的高表达可能是导致肾癌细胞增殖和侵袭能力增强的原因。BAP1与HAT1在肾癌组织中的表达具有显著相关性。