干扰HD-zipnl家族成员OsHox33的表达加速水稻叶片的衰老

HD—ZipⅢ基因家族成员在植物生长发育中起重要作用,主要涉及调控植物胚的发育模式、茎顶端分生组织的形成、叶片极性的形成、维管系统的发育等多个方面．尤其在植物叶片的发育中起重要作用．尽管HD-ZipⅢ家族成员在陆生植物中高度保守,但基于拟南芥多重突变体的遗传分析揭示了HD-ZipⅢ家族的功能在进化过程中已有所分化．本文报道了一个HD-ZipⅢ家族成员OsHox33,并分析了其功能,研究结果表明,其在水稻叶片衰老中起重要作用．为了揭示OsHox33的功能,本研究构建两个特异的RNkd载体（一个干涉片段来自OsHox33的5’端,另一个来自OsHox33的3’非翻译区）干扰OsHox33的表达,结果表明,两个载体的转基因植株都展示了叶片早衰的相似表型,表明干扰OsHox33的表达加速了水稻叶片的衰老．pOsHox33：：GUS及RT．PCR分析表明,OsHox33在水稻幼嫩的器官中有较高的表达,尤其在茎顶端分生组织、居间分生组织及愈伤等幼嫩组织有较高的表达．不同时期叶片实时定量PCR分析表明,OsHox33在水稻幼叶中有较高的表达,但在衰老叶片中表达降低．另外,不同时期叶片叶绿体电子显微镜超微结构显示,OsHox33RNAi转基因植株加速了叶绿体结构的降解,与OsHox33RNAi转基因植株的表型相一致．基因表达调控结果显示,OsHox33可以调控水稻叶片衰老特性基因GSI和GS2的表达,干扰OsHox33的表达降低了GSl的表达,但增加了GS2的表达．本文对于HD—zipⅢ家族在植物生长发育中的功能提供了新的理解．     

定位于类囊体膜的PPF1在转基因拟南芥中的表达影响叶绿体的发育

PPF1是一个与植物营养生长相关的基因.它编码的产物可能是一个膜蛋白并与拟南芥叶绿体中的类囊体蛋白ALB3有很高的同源性.免疫电镜分析表明PPF1蛋白同样主要定位于类囊体膜,而且在短日照G2豌豆开花两周后仍发育良好的叶绿体中有很高的表达,在长日照豌豆同时期非正常叶绿体中丰度非常低.对转基因拟南芥和野生型植株的叶片衰老进程比较发现, PPF1在拟南芥中的过量表达可以延缓叶片的衰老,而用PPF1反义mRNA抑制拟南芥中的同源基因ALB3则明显加快叶片衰老速度.对转基因拟南芥的超微结构分析显示,PPF1在拟南芥中过量表达时,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体大并含有更多的基粒和基质类囊体膜;相反,反义PPF1表达抑制其在拟南芥中的同源物时,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体小并含有较少的基粒和发育较差的类囊体膜系统.这些数据表明叶绿体的发育状况与PPF1或拟南芥同源物ALB3的表达水平呈正相关.我们的结果提示PPF1基因可能通过控制叶绿体的发育状况来调节植物的发育.     

定位于类囊体膜的PPF1在转基因拟南芥中的表达影响叶绿体的发育

PPF1是一个与植物营养生长相关的基因。它编码的产物可能是一个膜蛋白并与拟南芥叶绿体中的类囊体蛋白ALB3有很高的同源性。免疫电镜分析表明PPF1蛋白同样主要定位于类囊体膜 ,而且在短日照G2豌豆开花两周后仍发育良好的叶绿体中有很高的表达 ,在长日照豌豆同时期非正常叶绿体中丰度非常低。对转基因拟南芥和野生型植株的叶片衰老进程比较发现 ,PPF1在拟南芥中的过量表达可以延缓叶片的衰老 ,而用PPF1反义mRNA抑制拟南芥中的同源基因ALB3则明显加快叶片衰老速度。对转基因拟南芥的超微结构分析显示 ,PPF1在拟南芥中过量表达时 ,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体大并含有更多的基粒和基质类囊体膜 ;相反 ,反义PPF1表达抑制其在拟南芥中的同源物时 ,转基因植株的叶绿体比野生型植株的叶绿体小并含有较少的基粒和发育较差的类囊体膜系统。这些数据表明叶绿体的发育状况与PPF1或拟南芥同源物ALB3的表达水平呈正相关。我们的结果提示PPF1基因可能通过控制叶绿体的发育状况来调节植物的发育。     

谷氨酰胺合成酶基因GS1和GS2的高效表达增强转基因水稻对氮素缺乏的耐性

构建了同时含有胞质谷氨酰胺合成酶(GS1)cDNA和叶绿体谷氨酰胺合成酶(GS2)cDNA的植物表达载体p2GS,通过农杆菌介导法用它们转化了水稻品种"中花10号"的成熟胚愈伤组织,经潮霉素(Hyg)筛选培养及分化再生,获得了抗Hyg的转基因水稻植株.PCR和基因组Southern杂交分析结果证明,GS1和GS2基因均已经整合到转基因水稻的基因组内.Northern杂交实验结果证实,GS1和GS2基因在转基因水稻的转录水平上得到了有效表达.在以0.7 mmol/L的(NH4)2SO4取代了其中氮成分的MS培养基上测试植株生长量,结果表明转基因植株鲜重增长量显著高于对照,证明高效表达GS增强了转基因水稻对土壤氮素缺乏的耐性.     

小黑杨PsnHB22基因在烟草中的遗传转化研究

HD-Zip转录因子在光信号转导、非生物胁迫、叶片发育等方面发挥重要的作用，HB22转录因子是HD-ZipⅠ亚家族的成员之一。为研究PsnHB22基因的功能，从小黑杨（Populus simonii×P.nigra）cDNA中克隆PsnHB22基因并构建植物表达载体进行烟草（Nicotiana tabacum）的遗传转化，以获得该基因过量表达的转基因株系。对转基因株系进行PCR、qRT-PCR分子检测后观察表型，结果显示在营养生长时期，转基因烟草叶片窄小并且株高显著低于野生型对照。测定转基因烟草及野生型叶片的叶绿素含量，发现转基因烟草叶绿素含量显著高于野生型。由此推测PsnHB22基因在植株高生长、光合作用及叶片的形态建成等过程中起着重要的作用。     

类伸展蛋白OsPEX1对水稻花粉育性的影响

类伸展蛋白(Leucine-Rich Repeats Extensins,LRX)是一类细胞壁嵌合蛋白,其N端包含一个LRR(leucine-rich repeats)结构域,C端含Extensins结构域。研究表明,LRX基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉萌发和花粉管生长过程中具有重要作用,而水稻(Oryza sativa L.)LRX基因家族是否在调控花粉发育方面具有保守的生物学功能尚不清楚。本研究首先进行了生物信息学分析,结果显示,水稻LRX基因家族包括8个成员,OsPEX3、OsLRX3、OsLRX5位于水稻第1号染色体;OsLRX1、OsLRX3、OsLRX2、OsPEX1和OsPEX2分别位于第2、第5、第6、第11和第12号染色体,其中OsPEX1基因在花粉中高表达,暗示OsPEX1可能参与了花粉发育调控。为此,本研究采用RNAi技术进一步研究了OsPEX1基因对花粉发育的影响。结果表明,OsPEX1基因的RNAi转基因植株花粉败育,结实率仅为10%-30%。qRT-PCR分析显示,这些RNAi转基因植株OsPEX1基因表达量显著低于野生型,而且其表达量越低花粉育性亦随之降低。上述研究结果表明,水稻OsPEX1基因是水稻花粉发育的重要基因,该基因的克隆和功能分析有助于进一步阐明水稻花粉发育调控的分子遗传学机制。     

农杆菌介导的转谷氨酰胺合成酶基因小麦的抗除草剂特性研究

 谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS,E.C. 6.3.1.2）是植物氨同化过程中的关键酶,对植物的氮素吸收和代谢起着至关重要的作用。谷氨酰胺合成酶还是除草剂草胺膦(Phosphinothricin　(PPT)或Basta)的靶标酶。前期工作已从我国特有的豌豆(Pisum satium)品种中克隆了细胞质型谷氨酰胺合成酶（GS1）cDNA和叶绿体型谷氨酰胺合成酶（GS2）cDNA。为了验证谷氨酰胺合成酶的功能,构建了同时含有GS1 cDNA和GS2 cDNA的植物表达载体p2GS。以该表达载体通过农杆菌介导法,转化小麦(Triticum aestivum)的未成熟胚愈伤组织,经PPT筛选及分化再生培养,获得了抗PPT的转基因小麦植株41株。PCR和基因组Southern 杂交分析证实了GS1 和GS2基因已经整合到转基因小麦的基因组。用除草剂草胺膦Basta溶液涂抹转p2GS小麦叶片,结果证明GS转基因植株可以抗高达0.3%的 Basta溶液,而对照植株叶片逐渐变黄直至枯死。转基因小麦植株能正常结实。上述实验结果表明：1) GS基因在小麦植株中获得了有效表达,从而赋予小麦植株抗PPT特性;2) GS基因能够作为研究小麦遗传转化的筛选标记基因。     

HD-Zip III转录因子家族与植物细胞分化

细胞分化是生物生长发育的重要过程, 受到一系列信号的精确调控。植物特有的转录因子HD-Zip III在细胞分化中发挥了重要作用。该文对HD-Zip III基因类型和结构特点进行了简要介绍, 重点论述了HD-Zip III在胚胎形态发生、顶端分生组织形成、叶极性建立和维管组织分化等发育过程中的作用, 系统总结了HD-Zip III基因在不同层次受到的调控, 探讨了该家族基因与陆生维管植物进化的关系。     

转PSAG12-ipt基因水稻叶片中叶绿体超微结构的变化

研究了转PSAG12-ipt基因水稻和对照植株发育过程中叶片中的叶绿体结构的变化。发现水稻发育到乳熟期,转基因植株叶片中的叶绿体与对照植株开始出现明显的差别。对照叶绿体中嗜锇体体积增大,数目增多,大部分基粒的类囊体膜膨胀、裂解,片层结构解体。而转基因植株叶片中的叶绿体结构变化不大,嗜锇体相对有所增加,但体积较小,大部分基粒类囊体片层结构仍然排列整齐,少数类囊体垛叠化丧失。     

植物HD-Zip转录因子的生物学功能

HD-Zip转录因子属于Homeobox蛋白家族, 是植物特异转录因子, 由高度保守的HD(Homeodomain)结构域和Leu zipper(Zip)元件组成, 前者与DNA特异结合, 后者介导蛋白二聚体的形成。HD-Zip转录因子家族包括4个亚家族(HD-Zip Ⅰ-Ⅳ), 其成员通过与其他蛋白互作、参与激素介导的信号途径, 从而调控植物生长发育、光形态建成、花发育、果实发育和植物对逆境应答等生物学过程。文章对近几年关于植物HD-Zip转录因子参与上述生物学功能方面的研究进行了综述, 以期对新功能基因的挖掘和应用研究以及HD-Zip调控机制的阐明奠定基础。     

大豆生长素响应因子GmARF16参与调节叶片衰老进程

生长素响应因子(auxin response factors,ARFs)通过调节下游靶基因广泛参与植物生长发育过程,但ARFs如何调控植物叶片衰老的分子机制还不清楚。该文首先利用实时荧光定量PCR(q PCR)技术,分析大豆生长素响应基因Gm ARF16在叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老、外源植物生长素IAA处理条件下的表达模式,结果表明,该基因与叶片衰老调控密切相关,并且属于生长素的原初响应基因。为了进一步验证Gm ARF16基因的功能,采用农杆菌转化方法分别获得基因敲减(Gm ARF16-RNAi)和抗降解表达(m Gm ARF16)的转基因大豆植株。与非转基因对照相比,Gm ARF16-RNAi转基因大豆植株的叶片叶绿素含量和最大光量子效率(Fv/Fm)显著提高,叶片衰老标记基因(Gm CYSP1)的表达受到抑制,而m Gm ARF16转基因大豆植株则呈现出与Gm ARF16-RNAi转基因大豆植株相反的叶片生理表型。结果表明大豆生长素响应因子Gm ARF16正调节叶片的衰老进程。该研究表明,Gm ARF16在植物生长发育进程中发挥着重要作用。     

大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因

植物类受体蛋白激酶(plant receptor-like kinases RLKs)以其特有的结构在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要的作用。利用RNA干扰技术(RNA interference RNAi)来研究RLKs的功能已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因,在rlpk2-cDNA序列3'端选择312bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含rlpk2-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-R2,并转入农杆菌LBA4404。采用农杆菌介导大豆子叶节转化方法,共获得了三株转基因植株。转基因植株 RT-PCR分析表明rlpk2基因已被成功敲减(knock-down),并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力,结合前期研究结果,表明rlpk2基因可能在维持叶绿体的结构及保护叶绿体膜系统的完整性方面起负调节作用。     

水稻XIOsPR10基因表达调控的初步研究

为探索水稻PR10蛋白在水稻抗细菌性条斑病中的作用,构建了XIOsPR10基因的植物过量表达载体p1301-XIOsPR10及RNAi表达载体pDS1301-XIOsPR10,通过农杆菌介导分别转化水稻愈伤组织,获得了相应的再生植株.经GUS检测和PCR分析,证实XIOsPR10基因以及RNAi片段分别整合到水稻再生植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示,过量表达植株中XIOsPR10基因的表达量高于对照,而RNAi转基因植株中XIOsPR10基因的表达被抑制.     

过表达OsPSK3基因增加水稻叶片叶绿素含量

植物磺肽激素(Phytosulfokine,PSK)是新发现的一种能促进细胞分裂和分化的植物激素。水稻中该基因家族共有7个成员,迄今为止PSK基因在水稻体内的功能和调控机制仍不清楚。文章首先利用生物信息学手段对OsPSK家族基因进行了结构比较和进化分析,依据对水稻和拟南芥中PSK基因家族成员的分析认为:PSK祖先基因形成两个PSK基因的发生要早于单、双子叶植物的分化;其中OsPSK1与其余的OsPSK2-OsPSK7进化自不同的祖先基因。对PSK家族成员在不同组织的表达分析发现不同基因具有不同的表达模式。文章通过基因枪转化的方法获得了水稻OsPSK3转基因系。文章着重研究了OsPSK3过量表达对水稻植株生长的影响。结果表明:在转基因阳性株系中OsPSK3的表达量提高了约40%;且OsPSK3ox-1有明显优于对照的营养性状,表现在幼苗期产生更多的须根和根毛;在各生长阶段直至结穗期与对照相比表现出更高的株高;尤其在叶片叶绿素含量上,转基因系较对照提高了2.3倍。     

水稻PHD-finger转录因子基因OsMsr16增强耐盐性的可能性研究

Os Msr16(Oryza sativa L.multi-stress-responsive gene 16)是一个新的水稻植物同源结构域(PHD)-finger家族转录因子基因。之前研究显示,Os Msr16受到低温、高温和干旱胁迫的诱导表达。本研究中,q RT-PCR分析表明Os Msr16同样受到盐胁迫的诱导表达,推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。苗期盐处理条件下,与对照相比,过表达Os Msr16的转基因水稻植株叶片失绿面积较少,存活率更高。盐胁迫条件下,转基因植株中积累更高含量的脯氨酸和可溶性糖,而丙二醛含量和双氧水含量明显降低。转基因植株中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性明显高于对照。以上结果说明Os Msr16基因可能在植物防御盐胁迫过程中发挥重要作用。     

拟南芥HECT E3s家族基因表达模式和功能的初步研究

利用GUS组织化学染色法,研究由拟南芥泛素蛋白连接酶HECT家族基因(UPLs)启动子起始的β-葡萄糖苷酸酶报告基因(GUS)的表达模式。结果表明:UPLs家族中6个成员的启动子在拟南芥植株的不同组织和不同时期均有所表达,且在莲座叶发育的早期和衰老期表现出较高活性。进一步观察upl3和upl4突变体发现,upl3和upl4突变体除了upl3有较明显的叶型变化,两者均表现为延迟衰老现象;且突变体中衰老相关基因的表达水平不同于野生型。研究推测UPL3和UPL4可能参与了叶片生长发育过程的调控,同时还参与调控植株衰老进程。     

甜菜(Beta vulgaris L.)叶绿体转化体系建立及抗虫和抗除草剂植株的获得

为建立外源基因甜菜叶绿体转化体系,利用分子生物学方法构建了包含有编码苏云金芽孢杆菌晶体蛋白基因By crylAc 和编码膦丝菌素乙酰转移酶基因bar 的甜菜叶绿体转化载体pSKARBt/bar,以甜菜叶绿体基因组中atpB/rbcL做同源片段,以甜菜叶绿体16S启动子和终止子为调控基因,以bar矿基因为筛选标记基因.基因枪法转化甜菜叶柄,经筛选获得抗性转基因植株.对转基因植株进行外源基因 Bt crylAc和bar的PCR检测、DNA印迹分析,结果表明:外源基因Bt crylAc和bar确已导入到甜菜叶绿体基因组中.转基因植株除草剂抗性鉴定及其离体叶片虫试鉴定结果表明:转基因植株具有较强的杀虫活性和抗除草剂特性,表达了相应的蛋白质.研究结果还表明:bar基因在植物叶绿体转化中,既可以用作抗性基因,又可用作转化体筛选的标记基因.建立了甜菜叶绿体转化体系.     

白桦HD-Zip基因家族生物信息学及应答盐胁迫分析

HD-Zip转录因子蛋白家族是植物特有的一类转录因子蛋白,在植物生长发育和抵抗逆境胁迫等过程中发挥着重要作用。利用白桦全基因组数据库,获得白桦35条HD-Zip蛋白序列,参考拟南芥中该家族的分类方法,将这些成员分成HD-ZipⅠ-Ⅳ四个亚家族,并对这些成员的蛋白保守结构域、氨基酸组成、染色体分布、和理化性质等进行了预测和分析。从高盐处理的白桦幼苗根组织的转录组数据,鉴定了7个差异表达的基因。本研究为进一步研究白桦HD-Zip家族基因调控白桦耐盐性的功能提供了理论支持。     

高表达水稻WRKY72基因影响拟南芥生长素信号传导

植物转录调控因子WRKY基因家族是一个拥有众多成员的超家族,功能涵盖了植物生长发育的控制与抗病耐逆的调节。我们主要分析了OsWRKY72基因在外源植物拟南芥中的生物学功能。通过转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)的遗传学研究发现外源高表达该基因不单明显地抑制转基因植株的顶端优势,增强植株侧枝的生长,还改变了转基因植株叶片和角果的发育。进一步分析证实,高表达OsWRKY72基因所导致转基因拟南芥植株的表型和其它生理现象都与生长素信号通路改变所导致的表型和生理变化极其相近。这些结果说明OsWRKY72基因在外源植物拟南芥体内高表达后很可能改变了其正常的生长素信号通路。     

RNAi介导的OsBTF3基因沉默及其对水稻籽粒相关性状的影响

为了创制OsBTF3基因沉默的水稻植株、验证该基因在水稻籽粒相关性状中的功能、评价其在水稻遗传改良中潜在的应用价值,设计和合成OsBTF3基因序列的引物、扩增部分基因片段,构建RNAi基因沉默载体、通过农杆菌介导转化愈伤组织、植株再生、潮霉素抗性筛选和PCR验证、定量分析OsBTF3基因表达量,测定转基因水稻籽粒相关性状。结果表明,成功地获得了20个T1代OsBTF3-RNAi转基因株系,OsBTF3基因表达量得到显著的抑制和干扰,抑制效果平均达到85%;与野生型对照株相比,5个所测定RNAi转基因株系的穗长、穗粒数、千粒重和穗粒重等籽粒相关性状明显地减小或降低。因此,RNAi介导的基因沉默导致了OsBTF3基因表达水平抑制以及在籽粒性状中的功能缺失;OsBTF3可能是一个调控水稻籽粒相关性状重要的功能基因。