弓形虫基因缺陷虫株建立方法的初步研究

目的:应用电穿孔技术转染TgP24基因敲除转染质粒于弓形虫RH,探讨电穿孔技术的应用条件,以及TgP24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中筛选的最适条件.方法:设定所需的电穿孔参数、条件,如电压,电容,脉冲次数,电击杯的大小,电转染缓冲液,电穿孔后,将弓形虫悬浮液分别转移到长有不同贴壁细胞的培养瓶中,37℃,5%CO2(体积分数)的培养箱中培养,观察弓形虫的生长状况,并对不同电穿孔参数、条件下的弓形虫存活率进行比较.12hr后换成加有福来霉素的完全培养基中选择培养,不同时间观察虫体及细胞生长情况;在细胞中选择培养10天后,收集虫体,4℃下福来霉素处理7天,再回复到细胞内用选择培养基培养5天,收集虫体,腹腔注射昆明小鼠,大量收集弓形虫用于提取RNA进行RT-PCR.结果:优化电穿孔条件后的弓形虫存活率得到提高(P＜0.05);在选择浓度为5.0μg/ml-7.5μg/ml的福来霉素培养基中,筛选虫株采用L929细胞做为宿主细胞最为适合;RT-PCR结果显示L929细胞筛选基因敲除虫株的效果较好.结论:初步确定了弓形虫电穿孔技术的应用条件,以及Tg P24基因敲除质粒转染虫株在不同哺乳动物细胞中的最佳筛选条件;获得了较好的转染效率,为进一步研究弓形虫Tg P24基因敲除株的生物学特性打下了良好的基础.     

弓形虫与宿主细胞相互作用研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)在细胞内严格寄生,因此它能引起哺乳类宿主(包括人类)细胞的感染。凋亡在宿主细胞与弓形虫的相互作用中发挥着重要的作用。在未受感染的宿主细胞中,凋亡被间接机制所限制,因而宿主细胞能够对弓形虫发生炎症反应。与之相反,在被感染的宿主细胞中,由于凋亡信号级联反应直接受到了干扰,从而抑制了宿主细胞凋亡,这就有利于弓形虫在宿主细胞内的生存和发育。值得注意的是,弓形虫调节和抑制凋亡的两种能力,需要一个精密的调节系统来调控弓形虫和宿主细胞的相互作用,以维持弓形虫稳定的持续感染。重点从弓形虫有关的宿主细胞的凋亡方面进行了介绍。     

中药大蒜素体外抗弓形虫效应及其机制的研究

目的 观察大蒜提取物体外抗弓形虫的作用效果及其机制.方法 将弓形虫RH株速殖子与兔肾细胞共同培养,加入不同浓度的大蒜素(实验组)和磺胺嘧啶(阳性对照组),培养不同时间后取出细胞,固定染色后观察细胞感染率及每个纳虫泡中弓形虫速殖子的数量;采用MTT比色法观察大蒜素对弓形虫速殖子侵袭细胞及其正常细胞增殖的影响;采用台盼兰着色法观察大蒜素对弓形虫速殖子活性的影响;采用TUNEL末端标记法检测弓形虫速殖子凋亡率,对药物的效应和机制进行探讨.结果 (1)10～80 μg/ml的大蒜素能抗弓形虫的感染,呈现剂量依赖性,与时间无明显的相关性.(2)40 μg/ml、80 μg/ml的大蒜素不能抑制细胞的增殖,对细胞无明显的毒副作用;160 μg/ml的大蒜素对细胞有明显的毒副作用.(3)大蒜素80 μg/ml时,台盼兰着色率最高,弓形虫的活力最低.(4)大蒜素80 μg/ml的浓度时,弓形虫速殖子凋亡率最高.结论 大蒜素可以抑制弓形虫速殖子的活力、对宿主细胞的感染力、在细胞内的增殖,无明显的毒副作用,最适宜浓度为80 μg/ml.大蒜素是一种良好的抗弓形虫药物,诱导弓形虫速殖子凋亡是其抗弓形虫机制之一.     

弓形虫新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保护研究

采用牛物信息学方法对弓形虫新基因wx2进行表位分析预测,PCR扩增基因中编码2个表位的片段w2b和w2a,成功构建新基因的单表位疫苗质粒pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a和双表位疫苗pcDNA3-w2b2a,接种小鼠,观察表位疫苗的免疫保护作用.将表位疫苗分别通过肌肉注射免疫小鼠,对照组注射pcDNA3空质粒.ELJSA法检测血清IgG抗体水平,取脾细胞用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群.各组小鼠末次免疫后第4周每只小鼠经腹腔注射弓形虫速殖子500个,观察小鼠的生存时间.结果显示,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P＜0.05),且pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠脾细胞CD4 T与CD8 T淋巴细胞比值明显低于两单表位疫苗组,pcDNA3-W2a2b双表位疫苗组小鼠存活时间明显长于两单表位疫苗组(P＜0.05).实验结果表明,弓形虫新基因wz2表位疫苗能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,并且弓形虫poDNA3-W2b2a双表位疫苗的免疫保护性优于pcDNA3-W2b、pcDNA3-W2a两单表位疫苗.     

刚地弓形虫亲环蛋白基因TgCyP真核表达质粒的构建及其在Hela细胞内的表达

亲环蛋白(cyclophilin,CyP)是一类广泛存在于原核和真核生物体内的胞溶性蛋白,是刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)速殖子的主要成分,能够诱导产生IL-12和IFN-γ,在控制弓形虫急性感染过程中起重要作用.本研究根据GenBank发表的TgCyP基因序列,设计并合成一对包含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的引物,以cDNA为模板,应用PCR技术扩增TgCyP基因.PCR产物连接到pMD18-T克隆载体.用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切克隆载体,将TgCyP目的基因克隆到载体pVAX1,构建真核表达质粒pVAX1-TgCyP.将真核表达质粒转染Hela细胞,利用间接免疫荧光检测其在Hela细胞内的表达情况.结果表明扩增的TgCyP基因与GenBank上相应基因序列(U04633.1)的一致性达100%,构建的真核表达质粒pVAX1-TgCyP能在转染的Hela细胞中表达,其表达产物与刚地弓形虫阳性血清具有免疫反应性.本研究表明TgCyP有望作为弓形虫疫苗的候选抗原,将为进一步研究该质粒的动物免疫试验奠定基础.     

ToxoDB#17型弓形虫感染小鼠引起小肠潘氏细胞溶菌酶缺失

为探究Toxo DB#17型弓形虫对昆明小鼠小肠潘氏细胞(Paneth cells,PCs)溶菌酶的表达及小肠病理损伤特点,该研究以8周龄小鼠为研究对象,灌胃1×106个Toxo DB#17型弓形虫卵囊,分别在灌胃后6 HAI(hours after inoculation)、1 DAI(day after inoculation)、3 DAI、8 DAI取小肠各段,常规方法制作石蜡切片,HE和免疫组化染色,研究小肠病理损伤、虫体分布、潘氏细胞及溶菌酶表达特点。结果显示,小鼠弓形虫感染率为100%,弓形虫虫体抗原分布随时间延长呈增多趋势(P0.05),小肠的病理损伤随着弓形虫感染时间的延长,未见明显变化。小肠隐窝数、含潘氏细胞隐窝数、PCs总数和颗粒总数的变化总趋势呈现先减少后增加再减少的趋势,3 DAI数量较多(P0.05),潘氏细胞颗粒未观察到溶菌酶阳性染色反应。以上结果表明,Toxo DB#17型弓形虫抑制潘氏细胞溶菌酶的表达,对肠道损伤较轻,潘氏细胞及其分泌颗粒对弓形虫有应答反应,溶菌酶的缺失与Toxo DB#17型弓形虫成功入侵肠道有关。     

香菇多糖对急性弓形虫感染过程中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的调节作用研究

目的 探讨香菇多糖(Lentinan,Lent)对急性弓形虫感染BALB/c小鼠CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Tregs)数量和功能的调节作用.方法 对RH强毒株感染的BALB/c小鼠进行不同时间点的Lent预处理,动态观察用药后各组感染小鼠的生存率;在感染后第0、3、5、8和10天提取小鼠的脾细胞,FACS检测Tregs细胞数量的动态变化,ELISA法检测脾细胞培养上清中IL-10的分泌水平.结果 感染前6 d 1 mg/kg Lent用药组与药物未处理组相比显著提高了弓形虫感染小鼠的生存率;具有免疫抑制功能的Tregs数量于感染后8d达峰值,同时免疫应答中关键细胞因子IL-10的分泌水平也于感染后8d和10d显著增加.结论 对急性弓形虫感染的BALB/c小鼠采用Lent预处理之后能有效的调节Tregs的数量和功能,从而调控Th1/Th2之间的动态平衡达到治疗弓形虫的作用,为弓形虫病的临床治疗提供的新的理论依据.     

潘氏细胞在昆明小鼠弓形虫病发病过程中的变化

每只昆明小鼠灌胃1×104个弓形虫卵囊,分别在灌胃后1,3,5,6 DAI(days after inoculation),采用HE方法和免疫组织化学方法对小鼠回肠潘氏细胞的变化以及弓形虫在回肠的分布和数量进行研究,探讨潘氏细胞(paneth cells,PCs)在小鼠弓形虫病感染期间的变化。结果发现,回肠隐窝总数、含PCs的隐窝数、PCs总数及颗粒总数呈先增加后迅速减少至消失的趋势,回肠后段表现明显,6 DAI各参数与对照组比较差异显著(P0.05)。弓形虫在回肠中的分布面积呈增大趋势,6 DAI与1 DAI、3 DAI相比差异显著(P0.05)。该研究结果表明,弓形虫卵囊感染昆明小鼠可减少回肠潘氏细胞及其分泌颗粒的数量,为以小肠潘氏细胞为基础的弓形虫病的防治提供了实验依据。     

黑脊倒刺鲃精巢结构和精子发生的研究

用光学显微镜和电子显微镜研究了黑脊倒刺鲃精巢的组织结构和精子发生过程。精巢属于小叶型,由精小叶、小叶间质、壶腹腔和输出管构成。精小叶由各期生精细胞和支持细胞构成。除初级精原细胞以外的各期生精细胞和支持细胞组成了精小囊。每一精小囊中的生精细胞发育同步。成熟的精子从精小囊中释放出来,进入小叶腔中。在精巢的腹侧,小叶腔与壶腹腔连接。在壶腹腔的外侧,有一条与壶腹腔平行的输出管。壶腹腔与输出管相通。在壶腹腔和输出管中都充满精子。精巢的后端与贮精囊相连。贮精囊中充满形状不规则的腔隙。腔隙中有精子分布。输出管从精巢延伸出来,进入贮精囊中,位于贮精囊的一侧。左右两个贮精囊通向一条共同的输精管。输精管上皮具有分泌功能。精子发生在精小叶中进行。精子发生经历了初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞阶段。精子细胞经过精子形成过程,形成精子。     

用聚合酶链反应方法诊断弓形虫病

弓形虫病是一种人畜共患的传染病。目前对弓形虫病的实验室诊断,常用血清学和动物接种分离虫体法,但不够特异和灵敏,且不能短时有结果。可见,建立一种特异、灵敏和快速检测弓形虫基因组的方法,对弓形虫病的诊治是十分有意义的。作者从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出了一个弓形虫特异DNA片段的克隆(1.1kb),对克隆的片段用M13克隆和末端终止测序体系对部分片段进行了顺序分析。根据所得DNA顺序的数据,设计并合成若干长度为19～20NT的特异的寡核苷酸引物对,并建立体外扩增弓形     

刚地弓形虫RH株感染对小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响

目的 研究刚地弓形虫RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响及相关机制.方法 制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养皿,对照组加入DMEM高糖培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL)弓形虫速殖子培养6h、12h、24 h;以MTT法检测滋养细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cdk2表达或活性.结果 MTT法检测结果显示刚地弓形虫RH株抑制滋养层细胞增殖,且呈时间剂量依赖性;流式细胞仪检测24 h感染组细胞周期在S期产生阻滞,8×104/mL数量组S期细胞比例高达68.73％±1.76％;Western印迹方法分析感染弓形虫组滋养层细胞的cyclin A、cdk2蛋白表达量较对照组明显下降(P＜0.05).结论 刚地弓形虫RH株能够抑制小鼠胎盘滋养层细胞增殖并通过调节cyclinA、cdk2等蛋白表达或活性改变引起细胞S期阻滞.     

应用单克隆抗体测定人弓形虫IgM抗体的研究

为了检测人血清弓形虫ＩｇＭ抗体,采用抗人ＩｇＭ单克隆抗体和特异性抗弓形虫单克隆抗体建立捕获ＥＬＩＳＡ法,并与ＰＣＲ方法进行了比较。结果检测１０６５份献血员血清,检出阳性３例,用ＰＣＲ方法检测呈阳性结果;检测２３例类风湿病人血清及２份弓形虫ＩｇＧ抗体阳性血清均为阴性反应。说明该方法不受类风湿因子（ＲＦ）和特异性ＩｇＧ抗体的干扰,同时也表明捕获ＥＬＩＳＡ检测人血清中弓形虫ＩｇＭ抗体特异性,敏感性良好。     

弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合表达、纯化及抗原性分析

利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通过计算机分析,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白,用已知的6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的25%。纯化获得了表达的融合蛋白,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体,用于临床及孕妇检测,对优生优育有较大意义。     

弓形虫主要表面抗原基因克隆的初步研究

弓形虫是能够引起人、畜感染的专性细胞内寄生的原虫,世界各地人群感染率一般在25％～50％,正常人感染可不显示任何临床症状而成为带虫者,但是胎儿感染常可导致胎儿畸形、神经系统发育障碍、流产甚至死胎;免疫功能低下或免疫功能缺陷的病人(如恶性肿瘤、接受器官移植、AIDS病人等)并发弓形虫感染,尤其神经系统感染常是引起死亡的主要原因之一。因此,弓形虫感染的早期诊断研究及弓形虫疫苗的开发利用,对于提高新生儿素质、预     

人包皮传代细胞作为滋养细胞对人杂交瘤克隆生长的促进作用

用小鼠腹腔细胞等作为滋养细胞培养人杂交瘤,国内外均有报道。我们曾建立了人包皮传代细胞株。本文利用我们所建立的人包皮细胞做滋养细胞,并与小鼠腹腔细胞及不加滋养细胞的空白作对照,观察人包皮细胞对杂交瘤克隆生长的影响。 将人包皮细胞和小鼠腹腔细胞分别接种同一96孔板,次日将两株不同的人杂交瘤细胞1B4及1C8稀释至每毫升含10个或50个细胞,每孔接种0.1ml,使每孔分别含1个及5个细胞,经不同时间观察每孔杂交瘤克隆的生长情况,记录有杂交瘤生长的孔数。表1结果表明,     

腹腔饲养细胞制备方法的改进

腹腔饲养细胞制备方法的改进蒋春雷（第二军医大学神经生物学教研室,上海２００４３３）在组织细胞培养中,存在细胞浓度依赖性,单个或少数分散的细胞不易生长繁殖。在利用淋巴细胞杂交瘤技术合成单克隆抗体的细胞融合、克隆化等过程中,均直添加饲养细胞。小鼠腹腔细胞...     

宠物弓形虫的感染及其防控

弓形虫病是一种世界性分布的人兽共患寄生虫病,对人类,尤其是妇女、儿童危害很大,估计全世界有1/3人受到该病的威胁。孕妇感染弓形虫后导致早产、流产、胎儿发育畸形;弓形虫是免疫功能低下患者的主要死亡原因之一。犬、猫是弓形虫的中间宿主和终末宿主,是人类感染弓形虫的主要来源。随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的不断提高,城市中饲养犬、猫作为宠物的人越来越多,人、宠物间的亲密接触增加了弓形虫病传播给人的机会。加强对宠物犬、猫弓形虫病的研究及防控势在必行。本文就弓形虫的危害、宠物犬猫弓形虫感染及其防控措施作以综述。     

双歧杆菌及其表面分子的免疫增强作用

研究双歧杆菌及其脂磷壁酸、细胞壁肽聚糖、培养乏液对小鼠腹腔渗出细胞、脾细胞ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ、ＩＦＮ－γ活性和脾ＮＫ、ＬＡＫ细胞活性的影响。结果发现双歧杆菌全菌、脂磷壁酸、肽聚糖多次注入小鼠腹腔一段时间后,小鼠脾ＮＫ细胞、ＬＡＫ细胞活性和ＩＦＮ－γ活性增强,腹腔渗出细胞产生ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＴＮＦ活性增强,其中以脂磷壁酸作用最强,肽聚糖次之,培养乏液也有一定作用。双歧杆菌及其表面分子对小鼠脾细胞、腹腔渗出细胞ＩＬ－２活性无显著影响。双歧杆菌的免疫增强作用在抗感染、抗肿瘤机理中占有十分重要的地位。     

转移因子对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响和E玫瑰花形成的作用

本文报道了转移因子对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响和对脾细胞E玫瑰花形成的作用。转移因子为本单位从健康猪脾细胞提取的针剂,含多核苷酸和多肽等低分子生物活性物质,每支含量为3×10~3个脾细胞提取物,每天一次0.5ml剂量注入小鼠体内,连续5次后取动物腹腔巨噬细胞和脾细胞悬液,测定其吞噬功能并观察E玫瑰花形成作用。结果表明,转移因子对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的百分率和吞噬指数与对照组比有明显差异(P<0.01),对小鼠脾细胞E玫瑰花形成作用与对照组比差异也极显著(P<0.01)。从而看出,转移因子能使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能增强,亦能使特异的玫瑰花形成细胞中T淋巴细胞增多,增强了机体的免疫功能。     

弓形虫感染实验动物模型的特点及建模方案的选择

弓形虫感染对人类生活和畜牧业发展构成严重威胁。弓形虫感染实验动物模型是进行弓形虫学相关研究的基础条件之一。在实际研究工作中,根据不同的实验目的、选取不同的实验动物和以不同的实验方法所建立的实验动物模型,呈现出复杂和多变的特点。这一方面可以满足不同实验的需要,但同时也在实验结果的评价上导致一定程度的不足。根据弓形虫感染实验动物模型的不同特点,针对特定的实验目的,选择适合方法建立适合的实验动物模型,是进行相关弓形虫学研究的有效基础和前提。